感觉今年的国自然基金课题，没有免疫微环境是过不去这个坎了。博士师兄跟我说，今年他瞎编的基金都是免疫微环境！氨基酸代谢，特别是甲硫氨酸的代谢，与甲基化是密切相关的。而甲基化，又对免疫微环境有着千丝万缕的联系。今天讲的这篇文章是中山大学第一附属医院的医师，发表在13.7分的Cell Death Differ上的文章。这篇文章有意思的是，他们通过抽丝剥茧，分析出了甲硫氨酸诱导的免疫抑制轴（其实刚开始，只是筛选氨基酸，但通过不断地假设与假设的迭代，逐渐挖掘出整个调控肿瘤进展的轴，挺有意思，不清楚假设或者假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。好了，我们就来看看他们做了些什么吧：
首先他们想尝试分析氨基酸代谢的紊乱，是否会导致微环境中免疫的变化。于是他们用IFNγ来诱导I型干扰素产生，在这个过程中用氨基酸补充的方法，来分析具体哪个氨基酸过量，会抑制I型干扰素产生（这其实就是柯霍氏法则的验证，通过入关键因素，查看表型的变化，以此来分析差异，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。从众多氨基酸过量的实验中，他们发现甲硫氨酸增多，会抑制IFNβ的产生。而IFNγ诱导IFNβ的产生，需要通过几个途径，他们通过对这三组途径的关键基因敲除，发现MAVS是甲硫氨酸直接作用的下游。由于甲硫氨酸可以通过甲基化产生作用，于是他们又进一步分析了组蛋白甲基化，以及mRNA甲基化，确定了mRNA的m6A甲基化，是甲硫氨酸作用的关键。而通过筛选，他们发现甲硫氨酸促进差异表达，并且可以调控m6A甲基化的基因，交集只有一个，就是YTHDF1：
那YTHDF1和膀胱癌之间，是否存在这样的相关性呢？他们分析了膀胱癌的临床数据，发现YTHDF1的表达与膀胱癌预后较差有关。同时，膀胱癌中MAVS的上游蛋白RIG1的也得到了富集（RIG1是MAVS的上游，而MAVS下游则能激活NOD样受体信号通路和Toll样受体信号通路中的TBK1，以及凋亡信号通路和MAPK信号通路，都是与炎症密切相关的，不清楚这些信号通路的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列）：
那么YTHDF1作为一个甲基化的Reader，他需要做的就是结合m6A甲基化的mRNA，而RIG1则被发现具有m6A甲基化的情况。于是他们假设YTHDF1通过结合RIG1的mRNA上甲基化的位点，促进RIG1的表达（这就是假设的迭代，他们已知的信息是甲硫氨酸处理后，m6A甲基化产生变化，而能调控m6A甲基化的蛋白有差异的只有YTHDF1，而关键基因RIG1又存在m6A甲基化变化，同时YTHDF1和RIG1的表达呈负相关，通过这些已知的信息，迭代出了新的假设，这就是一个课题推进的过程，不清楚假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。他们用RIG1的甲基化位点突变，验证了这一点。RIG1的表达，的确是依赖于其m6A甲基化，以及其mRNA与YTHDF1结合的：
那么肿瘤中的YTHDF1的表达，对于微环境中其他免疫细胞，有什么样的影响呢？他们使用野生型和敲减了YTHDF1的肿瘤细胞的全肿瘤抗原，移植给小鼠，同时用Poly（I:C)诱导免疫，结果发现敲减了YTHDF1后，诱导的免疫细胞组表现出更强的效应T细胞分化且浸润的倾向。也就是说YTHDF1耗竭抑制了肿瘤抗原和MHC-I类分子的降解，增强了免疫细胞对肿瘤识别，恢复了肿瘤免疫监视：
那么甲硫氨酸作为更上游的机制，对于免疫微环境会产生什么样的影响呢？于是他们就做了一个单细胞测序，进行进一步分析（下图的UMAP图就是单细胞测序的结果，通过基因表达的多重主成因分析，进行降维就形成了这样的图形，不清楚的话，可以去看看《列文虎克读文献》和《夏老师带你读文献》）。结果发现，甲硫氨酸的缺陷，促进了膀胱癌中的免疫细胞浸润，并与PD-1抗体这样的免疫检查点抑制剂，产生了协同作用：
和限制甲硫氨酸一致的是，敲减了YTHDF1，也会产生同样的效果：
那么YTHDF1是如何影响PDL1/PD1的呢？这个和IFN-I类免疫又不一样了。于是他们就分析了YTHDF1结合的蛋白，结果发现YTHDF1可以结合eIF5B，这是一个与翻译相关的蛋白。而YTHDF1和eIF5B参与了PD-L1的翻译。他们在这里使用了甲硫氨酸以及敲减YTHDF1的验证（但实际上，更优的方法，是通过突变YTHDF1和eIF5B结合位点，然后再查看PD-L1的翻译影响，这样命题就由表达差异导致的PD-L1翻译变化，转换成了YTHDF1和eIF5B结合导致的PD-L1翻译变化，细品一下，这其实是两个命题，如果不仔细分析，可能就会造成肯定后件的逻辑谬误，不清楚命题差异和肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）：
为了使用到临床，他们选取了一种鼠伤寒沙门氏菌的抗肿瘤药物，这种沙门氏菌可以剥夺肿瘤的甲硫氨酸，引发肿瘤位置局部的甲硫氨酸缺陷。使用后发现，的确能增强小鼠的免疫细胞浸润，并提高小鼠肿瘤后的存活率，同时还能抑制PD-L1的表达：
这篇文章有意思的地方，就是他们首先是筛选出了甲硫氨酸造成的影响，并一步步把问题推进到了YTHDF1。而YTHDF1的功能又有两方面，一方面会通过结合甲硫氨酸造成的RIG1的m6A甲基化，促进RIG1降解，抑制IFN-I型免疫；另一方面YTHDF1通过eIF5B，促进了PD-L1的翻译，抑制免疫细胞：
这篇文章的机制算是挺有意思的，但有一些细节验证，还是稍有疏漏的，如果能够做得更严谨一些，可能可以发更高的文章。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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