近年来，多组学整合、前沿技术应用与多层次功能验证的结合，已成为生命科学研究的主流趋势。
本研究结合了非靶向代谢组学和靶向代谢组学，通过多组学整合与空间代谢组学技术，揭示了急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）的代谢和蛋白质组学特征，并利用功能验证实验和不同层次的实验模型，全面解析了AML的病理机制及其潜在治疗靶点，揭示了肌酸代谢通路在AML代谢重编程中的关键作用，并提出通过靶向肌酸转运蛋白（Slc6a8）干扰AML细胞的能量代谢，抑制其增殖和浸润。
知识点补充：靶向代谢组、非靶向代谢组和空间代谢组是代谢组学研究中的三种方法。
靶向代谢组
专注于
特定代谢物的定量分析
，具有高灵敏度和准确性，适用于验证已知代谢物或生物标志物；
非靶向代谢组
则
全面检测样本中的代谢物
，旨在发现新的生物标志物和代谢途径，适合探索性研究；
空间代谢组
通过成像技术
研究代谢物在组织或细胞中的空间分布
，提供高分辨率的空间信息，揭示代谢异质性。
这三种方法可以结合使用，能够从定量、全面和空间分布等多个维度提供更全面的代谢组学信息。
急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一种侵袭性癌症，其显著特征之一是代谢重编程。尽管AML的肝脏受累在诊断时通常表现为轻度且无症状，但尸检研究表明，40%-75%的AML病例存在肝脏浸润。这一现象提示，肝脏可能是白血病细胞的一个潜在独特生态位。然而，目前关于代谢物在AML肝脏微环境中的作用尚未完全阐明。
最新研究显示，AML细胞的代谢改变在很大程度上独立于遗传异常。这些细胞严重依赖氧化磷酸化（OXPHOS）来满足其能量需求，而对糖酵解的依赖性相对较低。与正常细胞相比，肿瘤细胞在氨基酸、脂质及其他代谢物的调控方面表现出显著的代谢差异。氨基酸在AML细胞中扮演着多重角色，包括参与蛋白质合成、能量供应、核苷酸合成、维持氧化还原平衡，以及通过稳态调节、表观遗传修饰和翻译后修饰等方式调控细胞功能。
本研究旨在揭示AML肿瘤微环境中的代谢重编程机制及其相互作用，并进一步筛选出能够阻断AML细胞增殖和浸润的潜在药物靶点。
1.使用空间代谢组学对白血病小鼠内源性代谢物进行空间分析
使用AFADESI-MSI技术对肝脏转移组织进行代谢物成像，分析肿瘤灶和瘤周区域的代谢差异。
共鉴定出100种在肿瘤灶（TF）和瘤周区域（PR）之间存在显著差异的代谢物，对这些差异代谢物进行代谢通路富集分析，发现它们在肿瘤代谢中起关键作用的通路中显著富集，主要包括精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢（图1B和C）。
主成分分析（PCA）表明，TF和PR表现出明显的聚类和分组趋势（图1D）。
此外，代谢物分类分析显示，分析显示有机酸及其衍生物（27.08%）以及脂质和类脂分子（32.29%）在肿瘤微环境中占主导地位，表明肿瘤微环境具有高度的代谢复杂性（图S1E）。
图1：使用 AFADESI-MSI 对白血病小鼠内源性代谢物进行空间代谢组学分析
2.通过非靶向代谢组学和蛋白组学验证区域特异性代谢重编程
通过非靶向代谢组学分析TF、PR和HC（健康对照）肝样本，验证MSI的结果。
既往研究表明，代谢物可以直接作为细胞间的通信信号，尤其是在癌症研究中。因此，研究人员进一步对TF、PR和HC肝样本进行了非靶向代谢组学分析，以验证和补充MSI的结果。
在本研究中，我们通过非靶向代谢组学阐明了三组之间显著差异表达的33种代谢物，
并通过热图展示（支持信息图S2A）。从MSI和非靶向代谢组学中得出的前10个富集通路，突出了共同的关键通路，如精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、甘油磷脂代谢和嘌呤代谢（图2B）。此外，前20个通路分析揭示了重要的代谢通路，包括组氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等（图S2B和S2C）。
值得注意的是，在KEGG通路的二级分类中，氨基酸代谢是两种分析中最显著富集的类别。PCA进一步证实了三组之间存在不同的代谢表型（图2C）。对重叠代谢物的检查显示，精氨酸和脯氨酸代谢特别富集（图2D和E），热图揭示了这些代谢物在各组中的独特分布模式（图2F和G）。这些结果表明，精氨酸和脯氨酸代谢通路中的代谢物可能发挥重要作用。
通过4D-DIA蛋白质组学分析了TF、PR和HC样本，
鉴定出多组差异蛋白质，其中1433个蛋白质在三组比较中共享。GO富集分析显示，PR与TF组中与小分子分解代谢和氨基酸代谢相关的生物过程下调，这与代谢组学结果一致。KEGG通路分析进一步表明，代谢类别（尤其是氨基酸代谢和能量代谢）在肿瘤组织中显著富集。特别是精氨酸和脯氨酸代谢通路在前20个通路中占据重要地位，提示其在AML肿瘤进展中的潜在关键作用。
同过代谢组和蛋白组的联合分析表明，AML肿瘤细胞中精氨酸和脯氨酸代谢显著紊乱，表明这一代谢通路可能在AML肿瘤进展中发挥重要作用。
图2：跨肿瘤组织代谢重编程的多组学分析
3.整合多组学分析揭示了精氨酸向肌酸通路的独特代谢重编程
通过质谱成像和蛋白质组学绘制了精氨酸和脯氨酸代谢通路中的关键代谢物和调控酶的全景图。
研究发现，精氨酸代谢在肿瘤组织中显著上调，并转向肌酸通路。关键代谢物如L-精氨酸、瓜氨酸、肌酸和亚精胺在肿瘤部位表现出特定的空间分布和表达变化。
此外，谷氨酰胺代谢和脯氨酸合成也发生了显著改变。这些发现揭示了AML肝转移中精氨酸代谢向肌酸通路的独特适应。
图3：AML 小鼠肝转
移中重编程精氨酸和脯氨酸代谢的可视化
4.通过临床样本进一步验证了AML中的代谢重编程现象
研究人员从6名AML患者（AML组）中收集了骨髓单个核细胞（BMNCs），并从10名非白血病患者（Ctrl组，合并为5个样本）中获取了CD34+ BMNCs。
蛋白质组学分析鉴定出Ctrl组和AML组之间的835个差异蛋白质，并将其与图2H中来自AML小鼠的1433个重叠差异蛋白质整合，最终识别出145个共同的差异蛋白质（图4A）。随后对这些145个差异蛋白质进行KEGG通路分析，发现其在特定类别中显著富集，尤其是代谢部分中的能量代谢和氨基酸代谢（图4B）。与之前的研究结果一致，关键代谢通路如氨基酸生物合成、氧化磷酸化、糖酵解和精氨酸生物合成显著富集（图4C）。
靶向代谢组学结果显示，AML患者中肌酸、磷酸肌酸、肌酐、L-精氨酸和瓜氨酸水平显著升高，而脯氨酸水平降低，这些结果与小鼠模型一致。
图4：在 AML 患者样本中验证了重编程代谢
5.AML肿瘤病灶中肌酸水平升高的机制
为了探索肌酸在AML小鼠中的作用，通过ELISA定量检测了肌酸浓度。结果显示，与健康对照组相比，AML小鼠血浆中的肌酸显著增加（图5B）。此外，在TF中也检测到肌酸水平的升高（图5C）。此外，与肌酸代谢相关的酶（如GATM、GAMT、Ckb）和转运蛋白（如Slc7a1、Slc6a9、Slc6a8）在蛋白质和RNA水平上均上调。这些结果表明，肌酸在AML肿瘤能量代谢中扮演重要角色，其合成和转运机制可能成为潜在的治疗靶点。
图5：通过生物合成和转运机制增强 AML 小鼠肝转移中的肌酸通路
6.通过体外和体内实验揭示了肌酸在白血病细胞增殖和转移中的关键作用
为了研究白血病细胞对肌酸增殖的依赖性，研究人员进行了细胞实验和动物实验。
细胞实验：
将不同髓系细胞系（分为M4亚型：C1498、MV4-11；M5亚型：MOLM-13、THP-1）分别置于含有5 mmol/L肌酸、10 mmol/L ompenaclid（肌酸转运蛋白Slc6a8的抑制剂）或两者组合的培养基中，分别在12、24和48小时的时间点进行观察。
结果表明：
不同髓系白血病细胞系（
C1498、MOLM-13、MV4-11、THP-1）对肌酸的依赖性不同，肌酸促进细胞增殖，而ompenaclid通过抑制肌酸转运蛋白Slc6a8显著抑制增殖。
动物实验：
为了阐明肌酸对体内肿瘤转移的影响，我们使用注射C1498-Luc/GFP细胞的AML小鼠模型。将AML小鼠分为对照组、肌酸组和ompenaclid组。IVIS成像显示，与对照组相比，在AML小鼠模型中，补充肌酸显著增加肿瘤转移，而ompenaclid治疗减少了转移扩散，且未观察到明显毒性副作用。
图6：肌酸在体外和体内促进 AML 细胞的增殖和浸润
