Mol Cell | 姚红杰团队开发R-loop单碱基分辨率检测新技术，并揭示R-loop调控基因表达的新机制

R-loop是由RNA:DNA杂合链和一条单链DNA组成的三链核酸结构，广泛存在于原核生物和真核生物基因 组中。R-loop与DNA损伤及修复、基因表达、细胞命运决定等生物学过程密切相关 【1-4】 ，其异常与多种疾病的发生密切相关 【5-8】 。然而，领域内已有R- loop检 测方法获得的R-loop信息存在诸多矛盾：R-loop的数量、分布、长度及序列在不同的检测中不能得到相互验证 【9】 。这 也导致R-loop研究长期存 在争议和不确定性，R-loop的精确定位和功能解析一直面临重大挑战。因此，突破传统的技术路径，开发一种高分辨率、高灵敏度、无偏好性的R-loop检测新技术，对于精准解析R-loop的生物学功能具有重要意义 。

2025年3月19日， 广州实验室研究员、广州医科大学特聘教授 姚红杰 科研团队在 Molecular Cell 在线发表题为 Base-pair resolution reveals clustered R-loops and DNA damage-susceptible R-loops 的研究论文。该团队成功开发了一项名为 RIAN-seq （R-loop Identification Assisted by Nucleases and Sequencing） 的技术，在单碱基分辨率水平实现了全基因组R-loop的高精度检测和功能解析，发现基因组中存在两类不同的R-loops，即：簇状R-loops （clustered R-loops） 和DNA损伤易感型R-loops （DNA damage susceptible R-loop, DdsR-loops） ；揭示启动子区clustered R-loops以数量依赖的方式调控基因表达，和DdsR-loops的序列特征及物种保守性。

研究团队开发的RIAN-seq技术通过酶解策略实现了对R-loops和RNA:DNA杂合链的精准检测：采用核酸酶P1、T5外切酶与Lambda外切酶的三联核酸酶体系，特异性降解基因组中的单链RNA、单链DNA及双链DNA等核酸组分，同时保留了完整的RNA:DNA杂合链这一核心靶标 （图1） 。 结合Tn5转座酶介导的建库策略，实现了检测灵敏度的数量级提升。

图1. RIAN-seq流程图。

为进一步分析技术分辨率，研究团队引入亚硫酸盐转化体系，通过特异性诱导胞嘧啶-胸腺嘧啶 （C/T） 碱基转换的分子标记，实现RNA:DNA杂合链的单碱基精度定位。RIAN-seq展现出多项革命性突破：在技术性能方面，具有卓越的检测重复性、优异信噪比及低测序深度需求 （~5 M reads） ；在检测效能维度，其捕获的R-loop数量较已有检测方法多一个数量级，可覆盖已有技术捕获到的大部分R-loop位点；在生物学突破方面，揭示了R-loop的新特征。该技术在全基因组范围内实现前所未有的R-loop检测分辨率，为揭示R-loop的生物学功能提供革命性的重要研究工具。

运用开发的RIAN-seq技术，研究团队在全基因组水平系统解析了人、小鼠和酵母等不同物种细胞系中R-loops的富集情况与分布特征。不同于传统方法捕获R-loops长度大于1 kb的特征，RIAN-seq揭示HEK293T、HeLa等哺乳动物细胞中的 R-loops大小主要集中在60-130 bp 。RIAN-seq能够在一个基因内检测到多达10个R-loops，甚至发现部分基因中R-loop的数量超过50个，而现有的技术在一个基因内只能观察到1-3个R-loop(s)。虽然RIAN-seq鉴定到的大部分R-loops与传统方法检测到的R-loops在空间分布上重合，但是不同于传统方法鉴定的R-loops宽度通常覆盖整个基因长度，RIAN-seq检测到的R-loops信号更为狭窄，且呈现簇状聚集特征。成簇R-loops在HEK293T、HeLa和mES细胞的基因组中占比分别为27.6%、13.16%、和29.95%。基于成簇的R-loops在基因组中广泛存在， 研究团队提出了“R-loop cluster” （R-loop簇） 的新概念来定义其发现的R-loop分布新特征，成簇分布的R-loops被定义为“clustered R-loops” 。这一发现与电子显微镜观察到的R-loops分布模式高度一致 【10】 ，进一步揭示了RIAN-seq技术的可靠性和先进性。

Clustered R-loops展现出独特的转录稳态维持功能。在DRB （苯并咪唑，抑制转录延伸） /Triptolide （雷公藤甲素，抑制转录起始） 诱导的转录抑制处理中， clustered R-loops表现出显著的稳定性，而且簇中R-loop位点的数量与其转录非依赖性呈正相关 。为了进一步研究clustered R-loops的生物学功能，研究团队进行了全局性的R-loops消解。RNA-seq数据表明，与含有非簇状R-loops的靶基因无明显基因表达变化相比， 含有clustered R-loops的基因表达显著下调，而且R-loop的数量与基因表达下调水平呈现严格的正相关。更为重要的是，这一相关性只在单个R-loop簇中R-loops数量达到5个及以上才会发生。以上结果表明，clustered R-loops对基因表达的调控具有显著的数量效应相关性。

研究团队发现，clustered R-loops具有显著的GC偏好性，在启动子区可特异性招募锌指转录因子 （如VEZF1、SP5等） 。R-loop簇中R-loops数量可触发转录因子的协同增强效应：单个R-loop簇中R-loops数量越多，VEZF1、SP5等锌指转录因子的结合基序越多；而R-loops的丢失则会导致基因表达下调越显著。研究团队进一步通过靶向编辑系统对clustered R-loops进行了功能扰动实验。结果表明， 只有当一个R-loop簇中所有的R-loops完全丢失时，转录因子结合和RNA聚合酶II的富集水平才会显著减少。因此研究团队 揭示了R-loop通过"定量模式"调控基因表达的新机制 （图2） 。 此项研究不仅实现从定性描述到定量解析的范式转变，更建立R-loop“分布-数量-调控”三位一体的理论框架，为R-loop功能的精准解析提供了全新维度。

图2. Clustered R-loops促进基因表达的模式图。

受限于传统方法的低分辨率，生理性和病理性R-loops的区别在领域内一直处于空白 【1】 ，尤其是引起基因组损伤的R-loop分子特征一直是领域内悬而未决的问题。通过不同R-loops诱导操作引起DNA损伤，研究团队鉴定并命名了一类驱动基因组不稳定的R-loops——“ DNA损伤易感型R-loops” （ DNA damage susceptible R-loops, DdsR-loops） 。这类R-loops展现出独特的分子特征，其5'和3'末端均携带高度保守的[Y(C/T)M(A/C)CAG]序列基序 （图3） 。功能解析揭示， DdsR-loops具有强烈的基因毒性效应，可显著诱导DNA双链断裂的频率 （γH2A.X显著升高） 。值得注意的是，DdsR-loops的序列特征在人类、小鼠、酵母等真核生物细胞中高度保守。

图3. RIAN-seq鉴定到的两类R-loops（Clustered R-loops和DdsR-loops）。

RIAN-seq的开发不仅解决了R-loop精准检测这一技术瓶颈，而且其高效性与低成本优势将为R-loop的基础研究和应用研究提供了有效的工具。 同时RIAN-seq发现的R-loops新特征也将拓宽R-loop的研究维度，为R-loop功能解析提供了全新视角。该研究获得了审稿人的高度评价，其中一位审稿人如此点评：“ The work was really exciting and I think it should become a new standard in the mapping of R-loops. RIAN-seq is a simple and elegant method. ”。

广州实验室/广州医科大学姚红杰团队的副研究员李尧益博士、中国科学院广州生物医药与健康研究院与中国科技大学联合培养博士生盛英梁同学为论文共同第一作者，姚红杰研究员为本文通讯作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.02.019

制版人： 十一