今天这篇文章其实挺有意思，是福建医科大学协和医院普外科潘誉团队的博士生，发表在10.3分的J Immunother Cancer上的，潘老师读硕士的时候就已经关注我了，现在都已经当通讯了。这篇文章其实做的是巨噬细胞的胞葬相关基因对胰腺癌免疫微环境的影响，作为一篇10分的文章，算是一篇不错的文章了：
胞葬大家应该熟悉了吧，说简单点儿，也就是巨噬细胞会把凋亡的或者快不行的细胞给吞噬掉的过程。肿瘤细胞增殖速度快，也会产生大量的凋亡细胞，而凋亡的细胞通过胞葬作用，会被巨噬细胞消化，这样就阻止了肿瘤微环境中免疫炎症的发生。于是他们想要检测的是肿瘤微环境中，巨噬细胞上胞葬相关的受体ANXA1（Annexin A1）的表达对微环境中肿瘤细胞的影响。首先他们分析了PDAC（胰腺导管腺癌）患者的TIMER（肿瘤免疫估计资源），主要看的是ANXA1的表达与CD68（巨噬细胞标志）以及Caspase3（这个应该不用多说了，就是细胞凋亡的标志物，不清楚的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼？》系列的细胞凋亡那几章）。结果发现ANXA1与CD68的表达呈正相关，而ANXA1与Caspase3的表达呈负相关：
这也就说明了ANXA1的表达可能与巨噬细胞有密切联系，同时ANXA1的表达增多，会抑制肿瘤细胞的凋亡产生。于是他们就根据这个结果提出了假设，假设ANXA1在巨噬细胞中的表达会影响巨噬细胞对凋亡单细胞的胞葬作用。通过特异性敲除髓系细胞的ANXA1，并进行荧光标记。他们发现特异性抑制巨噬细胞的ANXA1表达（这里其实也是柯霍氏法则的验证，通过ANXA1的巨噬细胞特异性缺失，来查看具体产生的胞葬作用表型是否受到了影响，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《轻松的文献导读》和《列文虎克读文献》），可以阻止巨噬细胞对于诱导凋亡的胸腺细胞的吞噬：
那么之前也提到过，凋亡的肿瘤细胞没有被及时清除的话，可能会导致肿瘤微环境中的炎症反应，会抑制肿瘤生长。于是他们就进行了体内实验，也就是分别检测野生型和髓系细胞特异性敲除ANXA1小鼠中，移植瘤的生长情况。结果发现，小鼠的髓系细胞特异性敲除ANXA1后，移植瘤的增殖明显受到了抑制，髓系特异性ANXA1缺陷，会导致凋亡细胞在肿瘤中积累。同样他们做了髓系特异性过表达ANXA1的验证，其实也得到了对应的结果，也就是髓系细胞特异性过表达ANXA1后，肿瘤细胞凋亡得到了抑制，肿瘤的生长加速了。为了说明是凋亡在其中产生的影响，他们还在小鼠的髓系细胞特异性敲除ANXA1后，使用了BAX的抑制剂（Bax在凋亡信号通路中，是关键的促凋亡蛋白，不记得的话可以回去翻翻《信号通路是什么鬼？》系列的凋亡那几章看看），结果发现阻断了肿瘤细胞凋亡，巨噬细胞的ANXA1缺失也不能造成肿瘤生长抑制了：
那么巨噬细胞的ANXA1特异性缺失，对肿瘤细胞会造成什么样的影响呢？于是他们对巨噬细胞缺失ANXA1的小鼠及野生型小鼠的移植瘤，进行了二代测序。通过富集发现巨噬细胞缺失ANXA1的小鼠中，肿瘤细胞中I型IFN-β反应相关的通路得到了富集，当使用了抗IFNR的抗体进行阻断，则能恢复肿瘤的生长。也就是说巨噬细胞中的ANXA1缺失，可能会激活肿瘤细胞的IFN-β反应相关的通路。那么IFN-β反应相关的通路是怎么激活的呢？要把这个和凋亡却没法被巨噬细胞清除的肿瘤细胞联系起来，其实也不是很复杂，因为凋亡的细胞中所产生的类似DNA片段，会激活cGAS-STING信号通路（这个就要回去再好好复习一下《信号通路是什么鬼？》系列的cGAS-STING信号通路了，都介绍过），而cGAS-STING信号通路代表了驱动抗肿瘤I型IFN反应的关键机制。他们也使用了cGAS-STING的抑制剂，验证了这个过程对于诱导肿瘤细胞增殖抑制的关键作用：
那么巨噬细胞的ANXA1特异性缺失对于肿瘤微环境，还会造成什么样的后果呢？于是他们分析了小鼠髓系细胞的ANXA1特异性缺失后，移植瘤微环境中免疫细胞的单细胞测序（下面的UMAP图，其实就是多维的PCA分析进行了降维处理，主要看的就是图上细胞的分簇情况，每个分簇代表了一类细胞，不清楚的话可以看看《夏老师带你读文献》和《列文虎克读文献》）。结果发现小鼠巨噬细胞的ANXA1特异性缺失，会诱导的肿瘤组织中，浸润的CD8+ T细胞、NK细胞和巨噬细胞的变化。伪时间图也说明了这个变化的过程，在巨噬细胞的ANXA1特异性缺失的小鼠中，CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的百分比并没有显著变化，但CD8+的肿瘤浸润T细胞分泌的GZMB（颗粒酶）、IFN-γ和Ki67表达升高，同时NK细胞的数量也增多了：
对于巨噬细胞本身，ANXA1的缺失，会诱导巨噬细胞产生M1极化。其实刚开始看到他们通过单细胞测序分析巨噬细胞极化变化用的还是体内实验，夏老师就寻思着，是不是应该有做体外实验来验证ANXA1缺失对于巨噬细胞本身的影响。然后就看到他们的确做了，就是从野生型和巨噬细胞ANXA1特异性缺失小鼠中，提取了BMDM（骨髓来源的巨噬细胞）来诱导M1或M2极化。结果发现巨噬细胞ANXA1特异性缺失小鼠中的BMDM更易被诱导成M1极化，而野生型则不然。这也就说明了巨噬细胞ANXA1特异性缺失，会促进巨噬细胞M1极化：
最后他们想要把这个研究的成果，扩大到临床的应用上，通过筛选，他们发现使用shANXA1进行ANXA1的敲减，可以有效地提高抗PD-1抗体/吉西他滨治疗联合使用过程中，对肿瘤的抑制作用，增强抗肿瘤反应：
总的来说，这篇文章还是不错的。但我们扩展一下思路，如果巨噬细胞本身ANXA1的缺失会影响巨噬细胞的极化，那么是不是可能会有这样的可能性：也就是巨噬细胞ANXA1特异性缺失抑制了巨噬细胞对于凋亡肿瘤细胞的胞葬作用，导致凋亡细胞的累积，从而反过来影响巨噬细胞的极化过程呢？这样其实就会形成一个Crosstalk的循环，实验设计的话，应该是一组共培养来分析凋亡细胞上清中，是否会产生诱导野生型BMDM极化的因素。不过这个其实都是将来可以深入探讨的问题，这里就不继续展开了。总的来说，这篇文章的确做得还不错，如果能做到Crosstalk的话，可能会更有亮点。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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