｜医学简讯｜体外多光子显微成像分析真皮胶原密度联合多种生物学指标多维度评价光老化

中华皮肤科杂志 · 公众号 · · 2023-10-17 17:41

正文

长期紫外线特别是长波紫外线（UVA）辐照能诱发皮肤光老化，导致皱纹形成、松弛下垂、色素沉着等。皮肤光老化以细胞外基质（ECM）的结构性改变为主要特征，真皮层胶原纤维发生降解，逐渐流失，影响真皮的正常功能。

光老化的临床评估主要应用无创性检测方法，评价皮肤皱纹、粗糙度、弹性和肤色等宏观指标，而基于皮肤细胞培养的体外研究虽然有助于研究可能的机制和通路，但结果往往难以直接与临床效应相联系。本研究建立并验证了一种基于体外重建皮肤模型的光老化评价方法，通过多光子显微成像定量分析真皮胶原密度，结合表皮形态、成纤维细胞数量等指标来评估防晒剂的光防护作用，有望进一步推广和应用。

一、材料和方法

1. 离体人皮肤组织样本： 经伦理委员会批准，收集4例女性志愿者（40 ~ 43岁，Fitzpatrick Ⅲ ~ Ⅳ型）腹部或乳房手术切除的皮肤组织样本。将离体皮肤样本进行体外培养，以UVA照射48 h，对样本进行多光子成像分析、天狼猩红（Sirius red）染色和苏木精-伊红染色分析，收集培养液测定基质金属蛋白酶（MMP）和Ⅰ型前胶原蛋白水平。

2. 体外重建全层皮肤模型： 经伦理委员会批准及患者知情同意，收集2例手术切除的皮肤组织样本，其中1例来自40岁男性腹部皮肤，另1例来自10岁男童包皮。最终选择前者分离培养皮肤成纤维细胞，并按照既定步骤构建体外全层皮肤模型，用于后续维生素C和防晒剂光防护作用的验证研究。

3. 测试配方： 研究对两种霜剂配方进行测试，配方A含6%甲氧基肉桂酸乙基己酯（美国亚什兰公司）和3%氧化锌（德国巴斯夫公司）两种防晒剂，防晒系数（SPF）为27 ± 2；配方B含10%奥克立林（德国巴斯夫公司）和6%对苯二亚甲基二樟脑磺酸（法国Chimex公司）两种防晒剂，SPF为18 ± 2。配方A对中波紫外线（UVB）的吸收效率更高，而配方B对UVA的吸收效率更高。

4. UVA光源和照射方法： 使用日光模拟器（法国Oriel公司）进行UVA照射，照射期间，将离体皮肤组织和重建皮肤模型的培养液替换为磷酸盐缓冲液（PBS），照射后更换培养皿并添加新鲜的常规培养液，在5%二氧化碳培养箱中放置48 h后进行测试。

5. 多光子成像和胶原蛋白定量： 收集离体皮肤组织和重建皮肤模型样本后，去除表皮层，以4%甲醛溶液固定真皮层，使用直立式共聚焦显微镜（日本尼康公司）进行多光子显微镜成像。激发光波长760 nm，胶原蛋白的荧光检测通道为370 ~ 390 nm。基于二维图像对胶原蛋白进行定量分析，从真-表皮连接（DEJ）至真皮深层连续选取50张截面进行自动处理。选取300 μm × 300 μm × 100 μm的视野区域对真皮层胶原蛋白进行三维图像重建。

6. 其他 实验方法及统计学分析详见原文。

二、结果

1. UVA照射导致离体皮肤组织的胶原蛋白密度和结构发生改变： 将4例离体皮肤组织用30 J/cm ² UVA照射48 h后，表皮和真皮组织学形态未见明显异常。但天狼猩红染色结果显示，UVA照射后DEJ下方的真皮乳头层胶原蛋白染色区域减少。使用多光子显微成像技术进一步定量真皮层胶原蛋白密度，结果同样表明，UVA照射后DEJ附近胶原蛋白密度显著降低。4例离体皮肤组织经UVA照射后，胶原蛋白密度下降8% ~ 47%，培养液中MMP1增加40% ~ 148%，MMP9增加42.55% ~ 87.95%，MMP8和MMP13的含量均低于定量限。研究者还发现，Ⅰ型前胶原蛋白的合成减少8.01% ~ 49.32%，提示Ⅰ型胶原蛋白α1（COL1A1）基因的下调也可能参与了UVA诱导的胶原蛋白密度降低。

此外，研究者还应用原子力显微镜（AFM）进一步观察了UVA照射对胶原纤维结构的影响，结果显示，对照皮肤样本真皮结构致密有序、胶原纤维结构完整，而30 J/cm ² UVA照射后真皮层出现胶原纤维断裂、排列无序。

2. UVA照射导致重建皮肤模型胶原蛋白密度降低： 同样将全层皮肤模型用30 J/cm ² UVA照射48 h后进行组织学检测。与离体皮肤组织不同，重建皮肤模型经UVA照射后结构发生显著改变，包括表皮颗粒层细胞减少、真皮成纤维细胞消失。天狼猩红染色结果显示，UVA照射后真皮胶原蛋白密度减低。多光子显微成像结果同样表明胶原蛋白含量显著减少，UVA照射后真皮浅层0 ~ 100 μm处胶原蛋白荧光信号强度降低约20%。此外，重建皮肤模型的MMP1和MMP9增加，Ⅰ型前胶原合成减少，这一趋势与离体皮肤结果一致，但只有重建皮肤模型在表皮和真皮均出现了明显的结构异常。

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