作者 l 辰羽和Self Renew
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细胞房间
大环化合物，包括大环多肽，由于其具有类似生物大分子药物的高活性及靶点选择性，又结合了小分子药物的生物代谢稳定、制造成本较低等优势（图1），成为一个优异的药物开发候选形态，在过去的二十年受到了科研界及工业界的广泛关注。
▲图1. 小分子药物、大环化合物及生物大分子的性质比较
得益于高通量筛选及理性设计工具的不断改进，大量的具有生物活性的大环化合物被不断发现。以噬菌体展示技术（Phage Display）筛选环状多肽的生物技术公司Bicycle Therapeutics于今年四月向美国SEC递交IPO申请，这引起了小编的关注；而另一大高通量筛选技术—mRNA展示技术，在大环药物筛选开发中的应用也逐渐崭露头角。本文根据小编的一些最新了解和认识，简单介绍一下基于mRNA展示技术的大环多肽筛选平台。
mRNA展示技术起源于Jack W. Szostak教授和Richard W.Roberts教授1997年发表在美国科学院院报（PNAS）上的突破性工作。他们创造性地利用了一种抗生素——嘌呤霉素，将其共价连接在mRNA片段的3'端，作为翻译过程的抑制原件。在核糖体翻译mRNA序列生成多肽时，核糖体可以识别嘌呤霉素，将其与多肽链共价连接，同时终止整个翻译过程（图2）。此时释放的多肽链通过嘌呤霉素完成了与其编码mRNA的偶连，实现了基因型（mRNA）到表型（多肽）的有机连接，初步完成了mRNA展示。这为后续高通量筛选奠定了基础。
▲图2. 嘌呤霉素共价连接mRNA与相应展示多肽流程图
为了拓展mRNA展示技术在大环多肽分子筛选中的应用，Szostak实验室分别于2005年和2012年在美国化学会杂志（JACS）发表多篇论文，进一步改进了筛选流程，实现了大环多肽的高通量展示和筛选，并在此过程中通过重构E.coli翻译系统（PURE）完成了非天然氨基酸的引入，使得可筛选的大环多肽库变得更具多样性。其筛选大致流程如下（图3）：首先他们通过合成引入编码随机氨基酸序列的mRNA池，并将其3'端与嘌呤霉素连接，经体外翻译得到mRNA融合的多肽库，目前理论库容量高达10^12−10^14的多肽库已被建立测试；随后，mRNA融合的多肽库，经过合适的化学修饰完成大环及多样性改造，同时通过逆转录过程将mRNA标签转化成稳定的cDNA-mRNA标签,便于筛选后的扩增测序；第三步，将得到的cDNA-mRNA融合的多肽库与固定化的靶点蛋白孵育（通常是基于生物素-亲和素相互作用的磁珠固定），洗去没有结合活性的分子，并富集出与靶点蛋白有高结合力的候选分子；最后，对其进行PCR扩增，得到相应的DNA编码库，并测序分析，得到筛选结果。这一轮筛选得到的候选分子，可由其DNA编码库经转录得到新的mRNA池，再与嘌呤霉素结合后，得到亚库，再继续新一轮的展示筛选，不断循环来对靶蛋白进行亲和力成熟，直至达到要求。
▲图3. 基本的mRNA展示筛选流程
Szostak实验室在利用mRNA展示技术构建大环化合物的高通筛选平台工作中，做出了奠基贡献。但在mRNA展示技术发展成熟的这几十年里，许多实验室参与完善并改进了其中的某些步骤（表1），使得mRNA展示技术不断更新并日趋实用。
▲表1. mRNA展示技术发展历程中的几次重大革新和成果
在这几次技术变革中，小编选择对东京大学Hiroaki Suga教授实验室的技术进行一个简单介绍，因为小编认为其创造性的发现使得mRNA展示技术在大环化合物类药物高通量筛选开发流程中的地位更显举足轻重。Suga教授曾在Szostak实验室接受博士后训练，其独立工作后在人工改造核酶（ribozyme，具有催化活性的RNA）领域不断探索，成功开发了能催化tRNA氨酰化的核酶，这类核酶对天然及非天然的氨基酸具有高度容忍性，将其成员组合使用，可以使400多个不同的氨基酸和tRNA任意组合，从而直接获得天然氨基酸或者非天然氨基酸活化的tRNA，使得后续的体外翻译用元件由原来的20多种，一下子拓展为400多种，Suga教授将这类核酶命名为flexizyme。Suga实验室随后应用flexizyme来生成氨基酸活化的tRNA，并且其应用到体外翻译系统，这一改进后的FIT系统使得非天然氨基酸的引入效率及多样性得到飞速提高。在这一FIT系统中，他们先使用flexizyme系统对要引入的衍生型非天然氨基酸与相应tRNA进行连接，随后将其作为氨基酸元件加入到PURE系统中，经翻译后引入生成的多肽链，从而直接获得所谓的非天然多肽（如自发成环的多肽等）（图4a）。Suga实验室随后将改进后的FIT系统引入mRNA展示流程中，生成了改进版的mRNA展示平台，这一平台可以快速构建并筛选库容量超过1012的非天然环肽化合物库，Suga教授将其称作RaPID平台。（图4b）
▲图4. FIT系统引入非天然氨基酸流程（a）及RaPID平台的筛选流程（b）
过去十数年，不少以大环化合类药物开发为核心目标的生物技术公司被创立。其中创立于2009年的Bicycle Therapeutics于今年四月刚刚申请IPO，受到广泛关注，小编平台也曾撰文进行报道。而以mRNA展示为核心技术的两家代表性公司成立更早，Ra Pharmaceuticals和PeptiDream分别于2008年创立于美国及2006年创立于日本。目前这两家公司均分别在美国纳斯达克及日本东京证券交易所完成上市，其中PeptiDream公司自2003年上市以来，股价一路上涨，目前市值已经超过70亿美金。
Ra Pharmaceuticals是Jack W. Szostak教授作为共同创始人成立的一家公司，核心技术是使用由Szostak实验室开发的大环多肽mRNA展示技术建立的Extreme Diversity™ 平台，目前公司主页报道的在研项目有六个（图5a），其中公司主推的项目主要与补体系统的C5蛋白抑制剂相关，是一个名为Zilucoplan的分子，其针对广义重症肌无力（gMG）的研究已经推进到了临床二期。Zilucoplan是由Ra Pharmaceuticals的多肽筛选平台得到的一个含有十五个氨基酸的环状多肽，其与C5蛋白结合的作用表位，和C5蛋白抑制剂——依库丽单抗（Eculizumab）完全不同区域（图5b）。Zilucoplan结合C5蛋白后，通过共价抑制C5蛋白分裂成C5a蛋白和 C5b蛋白而发挥作用。
▲图5. Ra Pharmaceuticals公司研发管线（a）及Zilucoplan与靶点作用位置（b）
PeptiDream是由Hiroaki Suga教授作为共同创始人成立的生物技术公司，其核心技术是基于Suga实验室开发的RaPID平台而建立的所谓的PDPS（Peptide DiscoveryPlatform System）技术。PeptiDream作为生物技术创新型公司，其立足于技术优势，专注于活性大环分子的快速筛选发现，其针对不同靶点，筛得到的各种有活性的苗头化合物，后续可以根据实际情况和需要，向多肽药物、小分子药物以及PDC等方向进行转化（图6a）。其披露的在研项目截止到今年3月末已经超过98个，但绝大部分属于苗头化合物或者临床前的项目，真正进入临床一期的项目只有两个。虽然其自研的项目推进缓慢，但已有多家大型制药企业与其建立研发合作（图7），其中Novartis、Lilly、Genentech、Merck等公司不仅与其签订了合作开发协议，还直接引进了其核心的PDPS（Peptide DiscoveryPlatform System）筛选技术。小编认为，这是PeptiDream重要的经营策略，即专注于自己核心技术的创新与改进，在广泛合作中扩大自己的影响力并获取巨大收益。
▲图6. PeptiDream公司的整体研发思路（a）及研发项目（b）
▲图7. PeptiDream公司的战略合作伙伴
小编总结
噬菌体展示、酵母表面展示等技术的贡献者们将基因型与表型相连，开发了利用生物体进化筛选和优化生物药的方法论。而日趋成熟的mRNA展示技术则为这种“link the genotype to phenotype”增添了更多理性设计和人为选择的成分，提升了库的多样性，拓宽了这一理念的想象空间。希望该技术能够为环肽药物的开发带来更多的落地产品，在工业界证明自身的价值。
参考资料
1. Huang Y, Wiedmann M M, Suga H. RNA display methods for the discovery of bioactive macrocycles[J]. Chemical reviews, 2018.
2. Josephson K, Ricardo A, Szostak J W. mRNA display: from basic principles to macrocycle drug discovery[J]. Drug Discovery Today, 2014, 19(4): 388-399.
3. Roberts R W, Szostak J W. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1997, 94(23): 12297-12302.
4．Ra Pharmaceuticals公司官网：
https://rapharma.com/
5．PeptiDream公司官网：
https://www.peptidream.com/
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