基于简化CRBN配体设计开发高效IRAK4靶向PROTAC

白细胞介素 -1 受体相关激酶 4 （ IRAK4 ）是先天免疫信号通路的关键调控因子，其激酶活性和支架功能双重作用导致传统抑制剂难以完全阻断炎症反应。近日， 清华大学饶燏团队 在《 Chinese Chemical Letters 》发表了题为 “ Developing potent anti-inflammatory IRAK4-targeting PROTACs with simplified CRBN ligands ” 的研究论文，报道 了一种 基于简化 CRBN 配体的 IRAK4 靶向 PROTAC 降解剂 LZ-07 ，该化合物 DC₅₀ 为 1.14 n M ， 在抗炎活性上 优于 临床 Ⅱ 期的 IRAK4 降解剂 KT-474 ，为自身免疫疾病治疗提供新 的 策略。

IRAK4 通过 Toll 样受体（ TLR ）和 IL-1 受体（ IL-1R ）信号通路激活 NF-κB 、 p38 、 IRF5/7 和 MAPK 等信号 通路，驱动炎症因子释放。即使 IRAK4 的 激酶活性被抑制，其 支架功能 仍可维持炎症信号传递（图 1A ）。临床 IRAK4 抑制剂（如 PF-06650833 ）仅靶向激酶活性，无法阻断支架功能，导致 抗炎效果 受限。 PROTAC 技术通过降解 IRAK4 蛋白可同时消除其 酶活和非酶活 功能， 对炎症的抑制更彻底。目前临床上现有 IRAK4 靶向 PROTAC 降解剂 KT-474 （图 1B ）的合成步骤较为复杂，从简单易得的商业化原料开始合成，需要经过 19 步反应。因此，开发合成路线更简洁、同时具备高效抗炎活性的 IRAK4 降解剂，仍具有重要的研究与应用价值 。

图 1. IRAK4 信 号通 路及代表 性的 IRAK 靶向 PROTACs 。（ A ） IRAK4 靶向小分子抑制剂和 PROTACs 的作用机制。（ B ） 代表性 的 IRAK4 靶向 PROTACs 。

针对以上问题， 研究团队 进行了 三 个 阶段 的 PROTAC 库构建与筛选 工作 （图 2A-C ） ，最终获得 高效 IRAK4 靶向 PROTAC 降解剂 LZ-07 ，具体研究如下：

1. 首轮筛选 ： 基于传统 E3 泛素连接酶配体（ CRBN/VHL ），以及不同类型的 IRAK4 配体，结合不同长度的刚性和柔性 linker 构建 了第一轮靶向 IRAK4 的 PROTAC 分子库，并结合高内涵成像筛选技术，快速发现了 先导分子 PL-01 ，但降解效率仅 26% 。

2. 二轮优化 对第一轮建库筛选到的高效 IRAK4 配体进行了结构优化，提高了合成的可及性，并结合度胺类 CRBN 配体进行了第二轮建库 ，获得 P L-18 （ 100 nM 蛋白 降解 超过 75% ）。

3. 三轮 优化 ： 针对度胺类 CRBN 配体可能的 IKZF1 和 IKZF3 等 脱靶 效应 ，引入 结构 简化 的 CRBN 配体 ， 最终获得 具有优异降解活性的 LZ-07 （ DC₅₀ = 1.14 nM ）及 LZ-22 （ 10 nM 诱导超过 8 0% IRAK4 蛋白降解 ）。

图 2. IRAK4 靶向 PROTAC 库的设计与构建。（ A ）第一代 IRAK4 靶向 PROTAC 库。（ B ）第二代 IRAK4 靶向 PROTAC 库。（ C ）使用简化的 CRBN 配体构建的第三代 IRAK4 靶向 PROTAC 库。

接下来，研究团队对 LZ-07 的降解效率和降解机制进行了研究，通过 WB 实验发现 LZ-07 能够浓度和时间依赖性的降解 IRAK4 蛋白（图 3A-C ），在 DOHH2 和 TMD8 两种细胞的 DC ₅₀ 值分别为 1.14 和 2.7 n M ，最大降解超过 90% 。 Rescue 实验进一步证实， IRAK4 的降解 是 通过 CRBN 介导的蛋白酶体途径实现 （图 3D ）。

图 3 . L Z- 07 的降解效率评估和降解机制研究。（ A ）用 LZ-07 和 KT-474 处理 TMD8 细胞 16 小时后， IRAK4 水平的免疫印迹分析。数据以均值 ± 标准差（ SD ）表示（ n = 3 ）。（ B ）用 LZ-07 和 KT-474 处理 DOHH2 细胞 16 小时后， IRAK4 水平的 免疫印迹分析。数据以均值 ± 标准差（ SD ）表示（ n = 3 ）。（ C ）用 50 nmol/L 的 LZ-07 处理 TMD8 细胞不同时间点后， IRAK4 的免疫印迹分析。（ D ）在 TMD8 细胞中，预先用 DMSO 、 MG132 （ 0.5 μ mol/L ）、 MLN4924 （ 0.5 μ mol/L ）、 pomalidomide （ 1 μ mol/L ）和抑制剂 compound E （ 1 μ mol/L ）处理 2 小时后，再用 LZ-07 （ 30 nmol/L ）处理 8 小时， IRAK4 水平的免疫印迹分析。

最后，研究团队在 PBMC 细胞中对 LZ-07 的抗炎效果进行了研究，发现 LZ-07 的抗炎效果要优于 KT-474 （图 4 A-D ），并且具有很好的安全性（图 4 E ）。

图 4. LZ-07 和 KT-474 在健康供体（供体 ID ： P122071008C ）来源的外周血单核细胞（ PBMCs ）中的抗炎效果评估。 PBMCs 先用 LZ-07 和 KT-474 预处理 2 小时，随后用 10μL 脂多糖（ LPS ， 100 ng/mL ）刺激 24 小时。采用 ELISA 法测定细胞因子（ IL-10 、 IL-6 、 IL-1β 和 TNF-α ）的水平。（ A-D ）分别显示 LZ-07 和 KT-474 对 IL-10 、 IL-6 、 TNF-α 和 IL-1β 水平的抑制作用。数据以均值 ± 标准差（ SD ）表示（ n=2 ）。最终的半数抑制浓度（ IC ₅₀ ）由 GraphPad Prism 9 生成。（ E ） LZ-07 和 KT-474 在两名健康供体（供体 ID ： P122071008C 和 Y1828 ）来源的 PBMCs 中的细胞毒性评估。（ F ） 用 LZ-07 和 KT-474 处理 PBMCs 细胞 16 小时后， IRAK4 水平的免疫印迹分析。

通过比较 LZ-07 与 KT-474 在 PBMC 细胞中的降解表现，研究发现 KT-474 对 IRAK4 的降解效率显著优于 LZ-07 ，然而在抑制多种炎症相关细胞因子分泌方面， LZ-07 却表现出更强的活性。研究团队推测，这可能归因于 LZ-07 保留了一定的 PI3Kδ 抑制活性（图 5 ），而 PI3Kδ 已知与炎症反应密切相关。实验结果显示， LZ-07 对 PI3Kδ 的抑制活性为 IC₅₀ = 92 nM ，这解释了 LZ-07 更优的抗炎效果 。

图 5. 经 LZ-07 处理 后对 PI3Kδ 的 激 酶抑制 效果 ，以 PI103 作为 阳性 对照。数据以均值 ± 标准差（ SD ）表示（ n = 2 ）

综上， LZ-07 是基于简化 CRBN 配体 开发 的 IRAK4 高效降解剂， 相较于 KT-474 具有其独特优势（图 6 ），其合成更为简便，抗炎效果更强，并且能避免传统度胺类 CRBN 配体带来的脱靶风险， 为红斑狼疮、特应性皮炎等自身免疫疾病提供全新治疗思路。

图 6. LZ-07 和 KT-474 在 IRAK4 蛋白降解能力、抗炎效果以及合成难度上的对比。

本文作者：LZ

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