Hey!朋友
们，馆长准时来报道啦！开头馆长再
次提一下“专业交流群”的事，还有谁没加入？近期群内为大家免费送上
国自然大礼包
及
单细胞、网络药理学
课程哦，速速联系小编进群吧~
昨天分享的科研科研CP“cGAS/STING+线粒体自噬”大家学的怎么样了？思路可一定得理清楚哈~今天咋们继续趁热打铁，再来一篇cGAS-STING信号通路相关文章，这篇文章又有新的发现了，快来做第一个吃螃蟹的人吧。
2023年11月，德国乌尔姆大学医学中心分子病毒学
研究所的Konstantin团队在
顶刊Nature Communications上发表了题为ARF1 prevents aberrant type I interferon induction by regulating STING activation and recycling的研究论文，该研究揭示了ARF1在cGAS-STING激活和信号终止中的作用。研究利用高通量测序技术、生物信息学工具、免疫共沉淀和质谱分析技术及共聚焦显微镜和超分辨率显微镜技术，进行分析和评估，极大地增加了结果的可靠性。
（PS：
馆长也可
以根据你的研究方向和需求，为你量身定制个性化的课题设计方案，确保你的研究具有创新性和可行性，为你的研究提供坚实的数据支持~有需要速速踢我吧！）
定制生信分析
云服务器租赁
加好友
备注“99”
领取试用
题目
：RF1通过调节STING的激活和循环来阻止I型干扰素的异常诱导
发表时间：
202
3
年
11
月
研究
背景
cGAS-STING信号通路在调控多种细胞功能及人类疾病发生中起着关键作用，尤其是在免疫应答和炎症反应中。ARF1是一种小GTP酶，研究发现其突变（如R99C）与I型干扰素病相关，突变导致ARF1的GTP酶活性降低，从而影响cGAS-STING信号通路的正常功能。
研究
主要
结果
展示
1.
ARF1突变定义为I型干扰素病
在一个患有冻疮狼疮皮肤病的患者（AGS460）样本中，发现在ARF1中存在新生c.295C>T/ p.（R99C）替代突变，并通过进一步研究发现ARF1中99号位置精氨酸的突变是一种以前未被识别的人类I型干扰素病的基础。
（a–g）9岁AGS460的手部(a)和面部(b)出现红斑性
血管炎冻疮样病变，同一患者18岁时的右手显示明显的组织损失(c)，患者RH2003（d，e）和KW2022（f，g）的手和脚上也观察到类似的病变，年龄分别为18岁和2岁；
（h）ARF1结构域结构示意图。残基R99用红色箭头表示；
（i）多重序列比对显示指定物种中ARF1残基R99的保守性；
（
j
）患者AGS3133的ISG概况（红色）与27名健康捐赠者的平均ISG概况（蓝色）。
2.
ARF1 R99C诱导STING依赖性I型IFN激活
在稳定表达STING（293-23-R232）的HEK293细胞中发现，ARF1 R99C的瞬时表达足以诱导剂量依赖的I型IFN信号传导，且
99位点的任何替代都会导致慢性I型IFN释放，ARF1 R99C诱导I型IFN信号通路需要STING，
内源性cGAS-STING蛋白足以诱导信号传导
。
与ARF1 R99C
共转染
后进一步研究发现，内源性STING蛋白数量的减少与STING激活导致的降解相一致，患者样品的研究结果再次验证了这一点
。
（a）
瞬时表达FLAG标记的ARF1 WT、R99C、Q71L或T31N的293-Dual-hSTING-R232细胞中SEAP报告基因的ISRE启动子活性（转染后32小时并标准化为细胞活力），下图：用抗FLAG染色的全细胞裂解物(WCL)的相应免疫印迹；
（b）
(a)中数据的曲线下面积分析；
（c）
在瞬时表达STING(+STING)或空载体(-STING)以及FLAG标记的ARF1 WT和R99C的HEK293T细胞中，通过Firefly荧光素酶(Fluc)定量测定ISRE启动子活性（转染后32小时，并标准化为GAPDH-海肾荧光素酶）。下图：抗FLAG染色的WCL的相应免疫印迹；
（d-
e
）
用ARF1 WT和R99C转导的A549 Dual细胞中的ISRE (d)或NF-κB (e)启动子活性，下图：用抗FLAG、抗STING和抗GAPDH染色的WCL的相应免疫印迹；
（
f
）瞬时表达指定ARF1构建体、cGAS和STING的HEK293T WCL的示例性免疫印迹，印迹用抗pTBK1、抗TBK1、抗IRF3、抗FLAG和抗GAPDH染色；
（
g
）（
f
）中pTBK1带强度的量化，标准化为TBK1；
（
h
）转导后72小时转导表达ARF1 WT和R99C的原代正常人肺成纤维细胞中OAS1 mRNA的qPCR，下图：用抗FLAG、抗STING和抗GAPDH染色的WCL的相应免疫印迹
；
（i）将来自健康供体(n1、f1)或患者(AGS460)的原代成纤维细胞的上清液(SN)转移至293-Dual-hSTING-R232细胞，转移后48小时SEAP (ISRE)活性并标准化为细胞活力。
3.
ARF1 R99C破坏线粒体，将mtDNA释放到细胞质中
在WT和cGAS-KO的THP-1单核细胞中通过慢病毒转导表达ARF1 WT和R99C，发现IFN信号仅在cGAS存在的情况下被诱导，表明
cGAS促进了ARF1 R99C诱导的I型IFN信号转导
。电镜显示ARF1 R99C存在时线粒体被破坏，R99c表达细胞的线粒体中可见小的电子致密颗粒，提示线粒体损伤。在mtDNA缺失后，ARF1 R99C表达诱导的IFNB1、Mx1和RSAD2的表达也降低了。这些数据表明ARF1 R99C的表达促进线粒体结构异常和mtDNA的释放以及cGAS的激活，最终诱导ISG的异常激活。
进一步电镜分析发现，在ARF1 R99C的存在下，线粒体分支长度增加，线粒体融合标记物MFN1在ARF1 R99C存在时显著积累，而在ARF1 WT中没有积累。在酵母中，进一步表明ARF1 R99C通过MFN1的积累促进线粒体的超灌注，导致mtDNA渗漏到细胞质中。
（a）
ISRE启动子活性通过转导表达ARF1 WT或R99C的THP-1-Dual WT（灰色）或cGAS KO（粉色）中的Lucia荧光素酶(LLuc)进行定量，下图：抗FLAG、抗STING、抗cGAS和抗GAPDH染色的WCL的相应免疫印迹；
（b）
瞬时表达ARF1 WT或R99C的HEK293T细胞的示例性电子显微镜分析；
（c）
示例性免疫印迹显示瞬时表达ARF1 WT、R99C、Q71L或载体的HEK293T细胞的分级；
（d）
(c)胞质部分中mtDNA (MT-D-Loop)的qPCR；
（e）
健康供体(n2、f1、I7)或患者(AGS460)的原代成纤维细胞胞质部分中mtDNA (MT-D-Loop)相对于总标准化细胞mtDNA（mtDNA/核 DNA）的qPCR；
（
f
）对稳定表达STING并通过ddC或未经处理(NT)耗尽mtDNA的U2OS细胞中的OAS1 mRNA进行qPCR；
（
g
）瞬时表达TagRFP标记的ARF1 WT、R99C或载体对照（红色）的HeLa细胞的示例性活细胞共焦激光扫描显微镜图像；
（
h
）分析图像的周长、圆度、分支长度（每个细胞）和分支（每个细胞）
；
（i）瞬时表达ARF1 WT、R99C或载体的HEK293T细胞的WCL免疫印迹示例，印迹用抗MFN1、抗RHOT1、抗FLAG和抗GAPDH染色；
（
j
）对瞬时表达ARF1 WT、R99C或载体对照的HEK293T细胞胞浆部分中的mtDNA (MT-D-Loop) 进行qPCR，以及标准化为细胞mtDNA（mtDNA/核 DNA）的VCP。
4.
R99突变会损害ARF1 GTP酶活性以及与COPI复合物的关联
结构分析显示，R99残基并不直接参与与GTP或其他ARF1相互作用伙伴的结合；亲和蛋白分析显示，R99C突变显著降低了与COPI通路蛋白的相互作用。
上述结果表明，R99C降低了构象稳定性、GTPase活性以及ARF1与COPI复合物组分的关联性。
（a）
ARF1 (PDB: 2J59) ATP结合模型（橙色/黄色），R99和D26突出显示；
（b-c）
ARF1 WT (b)或R99C (c)与GTP的相互作用以及通过荧光热位移测定分析的蛋白质稳定性；
（d）
从表达FLAG-ARF1的HEK293T细胞中纯化得到的所示ARF1突变体的GTP酶活性，下图：用抗FLAG染色的相应免疫印迹；
（e）
通过瞬时表达ARF1 WT或R99C的SEAP定量293-Dual-hSTING-R232细胞中的ISRE启动子活性，并指示GEF或GAP标准化为细胞活力。用抗HA、抗-turboGFP (tGFP)、抗-FLAG、抗-STING和抗-GAPDH染色的WCL的相应免疫印迹；
（
