近日，在Nature biotechnology (影响因子33.1) 期刊上发发表了一篇由诺贝尔奖得主Jennifer Doudna课题组投出的文章“Lung and liver editing by lipid nanoparticle delivery of a stable CRISPR–Cas9 ribonucleoprotein”。作者工程化了来自嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的热稳定Cas9（GeoCas9），以产生iGeoCas9变体，与原生GeoCas9酶相比，其对细胞和器官的基因组编辑能力提高了超过100倍。使用组织选择性LNP配方，在接收单次静脉注射iGeoCas9 RNP-LNP的小鼠的肝脏和肺中观察到16-37%的基因组编辑水平。此外，与可生物降解LNP复合的iGeoCas9 RNPs在肺组织中编辑致病的SFTPC基因，平均效率为19%，这比以往使用病毒或非病毒递送策略观察到的基因组编辑水平有了重大改进。这些结果表明，热稳定Cas9 RNP-LNP复合物可以扩大基因组编辑的治疗潜力。

在这项研究中作者使用了由锐讯生物美国公司研发的NanoGenerator Flex-M仪器（PreciGenome）用于制备总体积大于 200 μl 的LNP。

脂质纳米粒子（LNP）-mRNA复合物是一种非病毒衍生的体内递送载体，在肝脏基因组编辑方面取得了巨大成功。尽管LNPs能够递送编码Cre重组酶、荧光素酶和荧光蛋白的mRNAs到非肝脏器官，但将报告酶过渡到CRISPR mRNA和单导向RNA（sgRNA）的递送效率一直不高。LNP介导的CRISPR mRNA和sgRNA递送面临着sgRNA不稳定、mRNA介导的TLR激活以及编码基因组编辑器的大mRNAs翻译效率低的挑战。这些挑战是mRNA配方固有的，但可以通过替代的LNP递送载体来减轻。以核糖核蛋白（RNP）复合物的形式直接递送基因组编辑器有可能解决与基于mRNA和基于病毒的CRISPR编辑器传递相关的一些局限性。特别是与mRNA相比，RNPs引起的TLR激活水平较低，而且由于其细胞内半衰期较短，产生的脱靶DNA损伤最小。此

外与基于mRNA的递送方法相比，RNPs可避免大mRNA的原位翻译，并通过高亲和性Cas9与sgRNA结合提供天然保护，从而提供更高的体内编辑效率。基于LNP的RNPs成功递送策略具有巨大的转化潜力。然而，RNPs缺乏高效LNP封装所需的负电荷密度。此外配制LNPs的条件通常包括会使蛋白质变性的有机溶剂。虽然 RNP 形式的LNP介导的SpyCas9在肝脏中诱导了基因组编辑，但向肺等非肝脏器官的递送SpyCas9仍然效率低下。

基于LNP的RNP递送的蛋白质变性问题可以通过使用恒温CRISPR酶来解决。来自嗜热地衣芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的Cas9（GeoCas9）的RNP具有更高的热稳定性和更高的负电荷密度。因此在以 LNP 为介导的递送方面具有巨大潜力。在这项研究中，作者证明了实验室进化的GeoCas9突变体iGeoCas9s能够编辑哺乳动物细胞，其效率比野生型GeoCas9高出100倍以上，并且在LNP介导的递送之后能够有效地编辑细胞和动物器官。基于LNP的平台含有对pH值敏感的PEG化和阳离子脂质，能对小鼠神经祖细胞（NPC）、人胚胎肾293T细胞（HEK293T）和人支气管上皮细胞（HBE）进行iGeoCas9介导的编辑，效率视基因座而定，从4%到99% 不等。这些iGeoCas9 RNP-LNPs还能在与单链DNA模板共递送时诱导同源定向修复（HDR），并在单次静脉注射后高效地编辑小鼠的肝脏和肺部。例如，含有可生物降解阳离子脂质的iGeoCas9 RNP-LNP 配方在Ai9小鼠的整个肝脏种平均编辑了37%，在野生型小鼠中还以31%的效率编辑了PCSK9基因，与使用其他递送系统观察到的编辑水平相当。此外，含有酸性可降解阳离子脂质的iGeoCas9 RNP-LNP配方在Ai9鼠整个肺组织平均编辑了16%，还能以19%的效率编辑肺部的致病 SFTPC 基因，这表明iGeoCas9 RNP-LNPs有可能替代目前基于病毒或非病毒载体的递送策略。总之这些结果表明，可恒温的基因组编辑器与最佳的LNP配方相结合，可以在体外和体内有效地编辑细胞，是开发CRISPR治疗药物的一个前景广阔的平台。

在用锐讯生物的NanoGenerator Flex-M微流控制备LNPs时 ，先将 iGeoCas9和sgRNA以1:1.2的摩尔比混合组装成RNP，在 37 ℃温育10 分钟，然后与 100-nt enhDNA（相当于RNP的1.5当量）复合，再在 37 ℃温育10分钟，得到浓度为12-15 μM的RNP母液，存储在磷酸盐-海藻糖缓冲液中。然后，将RNP母液用柠檬酸钠缓冲液（10 mM，pH 5.0）稀释，最终RNP浓度为1.25 μM（最终pH约为5.2）或0.625μM（最终pH约为5.1）。乙醇和DMSO中的脂质母液分别以 10 mg ml ⁻¹ （FX12m配方）和 5 mg ml ⁻¹ （FX8m配方）的总脂质浓度准备。FX12m LNPs以4:1（水相比有机相）的体积比在 3 ml min ⁻¹ 的流速下进行微流控组装；FC8m LNPs以4:1（水相比有机相）的体积比在 2 ml min ⁻¹ 的流速下进行微流控组装。组装好的LNPs在室温下孵化20-30分钟，然后使用分子量截止值为10 kDa的透析膜在4°C下用PBS进行过夜透析。透析后，使用分子量截止值为100 kDa的Amicon超滤膜通过超滤浓缩LNPs。FC8m LNPs在浓缩步骤中被DTT激活。用PBS冲洗滤器三次，以收集吸附在滤膜上的剩余LNPs。将合并的LNP溶液用PBS稀释至用于动物实验的特定体积。

作者描述了一种可以用于体外和体内CRISPR基因组编辑的通用平台，该平台基于LNP介导递送RNP热稳定基因组编辑器。尽管RNP递送相比病毒或mRNA递送策略提供了几个潜在的优势，但其在体内基因组编辑中的应用通常限于基于局部给药或注射的组织编辑，或通过静脉注射进行的肝脏编辑。RNP递送通常依赖于不同的纳米颗粒材料来包裹和运输RNPs；然而它们在体内基因组编辑的应用通常受到颗粒均匀性差、稳定性和生物相容性差的限制。这里描述的热稳定iGeoCas9基因组编辑酶，以及新开发的LNP配方，使得RNP能够坚固地封装并实现小鼠组织选择性基因组编辑。经过工程改造的iGeoCas9突变体在与体内递送相关的多种条件下保持比常用的SpyCas9更高的稳定性，并且由于保留了分子结构的同时对功能有益的突变的耐受性，因此具有增强的基因组编辑能力。综合来看，LNP介导的iGeoCas9 RNP递送可能为靶向体内遗传治疗提供了一种新的方法。

本文所述的LNP辅助RNP递送可在小鼠肝脏和小鼠肺部产生体内基因组编辑，具体取决于LNP使用的配方。LNPs的静电荷特性可调节递送特异性。特别是与肝脏相比，用可生物降解阳离子脂质ADC制备的LNPs更倾向于靶向肺部。不同脂质成分的LNP或在不同条件下配制的LNP（如溶剂pH值、人工混合与微流控混合等）会导致纳米颗粒的不同表面特性，并诱导可调整的递送特异性。此外，作者还观察到了向体内更具挑战性的细胞类型递送的迹象，心脏的低水平基因组编辑就是证明，这表明有可能筛选和优化新的LNP配方，进一步扩大递送的特异性向更具挑战性靶点递送RNP-LNP。这些发现共同证明了RNP-LNPs在肝脏以外的组织中进行体内外基因组编辑的实用性，并表明它们在扩展CRISPR-Cas9基因组疗法的应用方面具有巨大潜力。

诺奖得主Jennifer Doudna

原文链接： https://doi.org/10.1038/s41587-024-02437-3