中国海洋大学郑浩团队JHM：环境相关浓度下手性杀菌剂三唑酮扰乱草金鱼昼夜节律行为的对映选择性机制

图文摘要

成果简介

近日，中国海洋大学郑浩教授团队在 Journal of Hazardous Materials 上发表了题为 “ Enantioselective disruption of circadian rhythm behavior in goldfish (Carassius auratus) induced by chiral fungicide triadimefon at environmentally-relevant concentration ” 的研究论文（ DOI ： 10.1016/j.jhazmat.2024.136891 ）。论文针对环境相关浓度下手性三唑类杀菌剂（ TFs ）两种对映体如何差异地影响鱼类生态行为，尤其是昼夜节律行为这一关键科学问题，从对映体视角揭示了水环境相关浓度下 TFs 两种对映体扰乱草金鱼昼夜节律行为的对映选择性机制，明确了肠道有益菌在“脑 - 肠”轴调控昼夜节律行为中的重要作用，为准确评估“同一健康”（ One Health ）框架下淡水生态系统中手性农药残留生态风险的早期预警提供了新见解和新手段 。

引言

农用化学品残留威胁着全球生物多样性、粮食安全和人类健康，全球约 40% 的农用化学品具有手性结构。其中，三唑类杀菌剂（ TFs ）通过干扰麦角甾醇的生物合成有效地抑制真菌生长，在农业生产中发挥着不可替代的作用，且超过 84% 的 TFs 具有手性结构。尽管对映体间具有相似的理化性质，但其环境行为、生物活性和生物毒性却往往表现出较大的差异，即对映选择性。然而，当前研究大多以外消旋体（即对映体等比例混合物）为研究对象，仅少量的研究从对映体角度关注了 TFs 对鱼类的急性致死性和发育毒性，但这些效应浓度远远高于 TFs 的环境浓度，且仅关注了鱼类个体水平上的响应，忽略了更具生态相关性的种群水平上对映体胁迫作用的差异。因此， 采用比传统毒理学致死终点更具敏感性、预测性和预防性的新手段，在环境相关浓度下，从对映体的视角阐明鱼类种群对水生生态系统中 TFs 对映体污染的响应差异和机制，是在“ One Health ”框架下准确评估水环境手性农药污染的生态风险的当务之急 。

近年来，行为生态毒理学因其敏感性强、易观测及生态相关性高等优势，逐渐成为污染物环境生态风险评估中的重要工具。节律行为是指其行为活动适应外界环境因素（如光照和温度）的周期性变化而发生有节律性的变动，包括多年节律、季节节律、月节律和昼夜节律等。其中，昼夜节律行为是受生物钟调控的最表观的变化，有助于生物适应环境的变化并高效地利用资源和能量，对其自身的生存和繁殖至关重要。鱼类的个体运动、摄食、群体集群和迁徙等行为均表现出明显的昼夜节律。越来越多的研究发现，引起水域生态环境恶化和渔业资源衰退的环境污染物是引起生物昼夜节律失调的一个重要原因。 然而，目前仅有少量研究关注了 TFs 对鱼类运动、繁殖等行为的影响，但忽略了手性农药不同对映体间的对映选择性，且不同 TFs 对映体如何影响鱼类昼夜节律行为尚不清楚。

图文导读

图 1. 本研究实验设计示意图

1. TDF 对映体引发了幼鱼群体昼夜节律行为对映选择性紊乱

TDF 对映体对幼鱼群体昼夜节律行为的影响如图 2 所示。在为期 14 天的暴露中，所有处理组中均没有幼鱼死亡，表明环境相关暴露浓度 (100 μg L ^-1 ) 下 TDF 对映体和外消旋体均不会对金鱼幼鱼产生致死效应 。对照组中，鱼群的个体间距离表现出夜晚显著大于白天、游泳速度同步性表现出夜晚显著低于白天的规律，说明幼鱼群体具有白天紧密协调，夜晚松散自由的昼夜节律（图 2b-c ）。然而， S (+)-TDF 使鱼群白天的个体间距离显著提高了 14.92% ， R (-)-TDF 使鱼群夜间的个体间距离降低了 7.96% （图 2b ），且两种 TDF 对映体污染暴露使鱼群白天的游泳速度同步性降低了 3.35~5.72% （图 2c ）。值得注意的是，相较于对照组鱼群的昼夜节律（凝聚力 < 1 ，协调性 > 1 ）， S (+)-TDF 对映体颠倒了幼鱼集群行为的昼夜节律（凝聚力 > 1 协调性 < 1 ）（图 2d-e ）。 这些结果说明，对映体 S (+)-TDF 较 R (-)-TDF 更强地扰乱了幼鱼集群行为的昼夜节律，证实了 TDF 对映体能够对映选择性地扰乱金鱼幼鱼集群行为的昼夜节律 。

图 2. TDF 对映体诱导幼鱼群体昼夜节律行为紊乱

（ b ）个体间距离；（ c ）游泳速度同步性；（ d ）个体间距离的昼夜比；（ e ）游泳速度同步性的昼夜比

TDF 对映体差异地诱导了幼鱼个体昼夜节律行为紊乱

TDF 对映体对幼鱼个体昼夜节律行为的影响如图 3 所示。在整个日夜周期中，对照组幼鱼均倾向于分布在趋向区（图 3a ），说明幼鱼个体的勇敢性没有昼夜节律性。然而， TDF 对映体暴露使幼鱼对中心区表现出更强的偏好（图 3b ），且具有 S (+)-TDF 强于 R (-)-TDF 的对映选择性，中心区的停留时间百分比进一步证实了上述结论（图 3c ）。 R (-)-TDF 和 S (+)-TDF 使幼鱼个体勇敢性的昼夜比分别变为 0.86 （ < 1 ）和 1.30 （ >1 ）（图 2d ），说明 TDF 污染暴露使幼鱼勇敢性出现昼夜节律性。另外，对照组幼鱼的平均速度（图 2e ）具有白天高于夜间的规律，说明幼鱼个体活跃性存在昼行夜伏的节律性。 S (+)-TDF 较 R (-)-TDF 更强地抑制了幼鱼个体日间活跃性（图 2e ），且相比于对照组幼鱼平均速度的昼夜比， S (+)-TDF 较 R (-)-TDF 更显著地扰乱了幼鱼个体昼行夜伏的节律性，甚至使这一节律消失（图 2f ）。另外，个体行为和群体行为具有显著的相关性 （图 3g ）。 这些结果均说明 S (+)-TDF 更强地扰乱了幼鱼个体昼行夜伏的节律性 ，且个体节律性的改变是 TDF 对映体差异地扰乱幼鱼集群行为昼夜节律的关键原因（图 3h ） 。

图 2 ： (a) 共沸相关的三个区域示意图；蓝色虚线表示 NAPL- 水界面附近的局部平衡区；橙色虚线表示受共沸影响的区域；灰色虚线表示未受共沸影响的区域。 NAPL 去除速率（ R ）和温度随时间的变化，温度传感器的位置： (b) 位于加热器附近、未受共沸影响的区域； (c) 位于远离加热器、未受共沸影响的区域； (d) 位于受共沸影响的非平衡区； (e) 位于局部热平衡区。

TDF 对映体在幼鱼组织中的对映选择性累积

图 4.TDF 对映体在幼鱼组织中的累积量

（ a ）不同组织中 TDF 对映体的累积量；（ b ） TDF 对映体的 BCF 值；（ c ） TDF 对映体在幼鱼不同组织中的分布模式

1. TDF 对映体差异地导致了幼鱼“脑 - 肠”轴调节异常

图 5. TDF 对映体对幼鱼“脑 - 肠”轴稳态的影响

（ a ）脑组织 c-Fos 的代表性显微照片：蓝色（ DAPI ）和绿色（ c-Fos ）荧光分别代表细胞核和神经元活性；（ b ）视顶盖中 c-Fos 半定量；（ c-d ）脑组织中 SOD 酶和 AChE 酶活性；（ e ）脑组织中的 MDA 含量；（ f-g ）肠道 H&E 和 AB-PAS 染色的代表性显微照片：蓝色箭头表示空泡化，黄色箭头表示杯状细胞坏死，红色箭头表示肠绒毛破裂，绿色箭头表示杯状细胞，绿色方框表示粘液层；（ h ）肠绒毛高度；（ i ）杯状细胞数量；（ j ）肠组织中 SOD 酶活性；（ k ）肠组织中 MDA 含量。

肠道有益菌缓解了 TDF 对映体暴露造成的损伤

益生菌干预对幼鱼昼夜节律行为和“脑 - 肠”轴调节的影响如图 6 所示。益生菌干预的对照组（ P#CK ）与空白对照组中幼鱼的昼夜节律性一致（图 6a-d ），说明肠道有益菌的增多不影响金鱼固有的昼夜节律。然而，相比于 S (+)-TDF ，益生菌干预（ P# S (+)-TDF ）显著恢复了 S (+)-TDF 引起的昼夜节律行为紊乱（图 6a-d ）并减少了其在幼鱼脑和肠等组织中的累积量（图 6e-h ）， 说明肠道益生菌的增多可降低 S (+)-TDF 对映体在金鱼体内的富集能力，因而缓解 S (+)-TDF 诱导的昼夜节律紊乱。 另外，益生菌干预后幼鱼的肠道组织病理损伤（图 6i ）和氧化损伤（图 6j ）明显减少，大脑的氧化损伤（图 6k ）和胆碱能系统功能（图 6l ）也有所恢复， 这些结果说明了肠道有益菌可以恢复肠屏障完整，进而经“脑 - 肠”轴通路缓解 TDF 诱导的金鱼昼夜节律紊乱，间接证实了肠道有益菌失衡是 TDF 诱导金鱼昼夜节律紊乱的关键原因（图 6m ） 。

图 6. 益生菌干预对幼鱼昼夜节律行为和“脑 - 肠”轴调节的影响

（ a ）个体间距离昼夜比；（ b ）游泳速度同步性昼夜比；（ c ）中心区运动距离百分比昼夜比；（ d ）平均速度昼夜比；（ e-h ）大脑、肠道、鳃和肌肉中对映体累积量；（ i ）归一化的肠绒毛高度；（ j ）归一化的肠道 MDA 含量；（ k ）归一化的大脑 MDA 含量；（ l ）归一化的大脑 AChE 酶活性；（ m ）肠道有益菌缓解 TDF 对映体暴露造成的损伤示意图。

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针对环境相关浓度下手性 TFs 对映体对鱼类昼夜节律行为的差异影响及机制仍不清楚的问题，本研究从对映体的角度证实了手性杀菌剂 TDF 两种对映体均扰乱了金鱼个体和群体昼夜节律行为，且具有 S (+)-TDF > R (-)-TDF 的对映选择性规律。这主要归因于 S (+)-TDF 较 R (-)-TDF 更易富集在金鱼体内，并表现出脑 > 鳃 > 肠 > 肌肉的富集特征。一方面，脑组织中差异累积的 TDF 对映体通过诱发氧化损伤介导的胆碱能系统功能障碍，对映选择性地导致视觉中枢神经信号传导受阻，这被认为是 TDF 对应选择性地扰乱幼鱼昼夜节律的关键原因。另一方面，肠道中累积的 TDF 对映体差异地诱导氧化损伤，破坏了肠道物理和化学屏障，因而扰乱了“脑 - 肠”轴的调节稳态（图 7 ）。 研究结果从对映体视角揭示了水环境相关浓度下手性 TFs 扰乱鱼类昼夜节律行为的对映选择性机制，为准确评估淡水生态系统中手性农药残留生态风险提供了新见解，为手性 TFs 早期预警提供了新手段 。

图 7. 手性杀菌剂 TDF 诱导的金鱼昼夜节律对映选择性紊乱机制示意图

该项研究得到了国家自然科学基金（ 42307515 ）、山东省杰出青年基金（ 2023GJJLJRC-05 ）、中国博士后科学基金（ 2024M753055 ）以及山东省博士后创新计划（ SDCX-ZG-202400183 ）等项目的资助。