时空组学 | 食管癌发生单细胞多阶段空间演化图谱 | Cancer Cell

Basic Information

• 英文标题：Single-cell multi-stage spatial evolutional map of esophageal carcinogenesis
• 中文标题：食管癌发生单细胞多阶段空间演化图谱
• 发表日期：10 March 2025
• 文章类型：Article
• 所属期刊：Cancer Cell
• 文章作者：Jiang Chang | Chen Wu
• 文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610825000613

Highlights

Para_01

1. 单细胞空间图谱描绘了人类食管鳞状细胞癌的进化轨迹
2. 侵袭性细胞通过破坏上皮-基质界面推动食管鳞状细胞癌的发展
3. JAG1-NOTCH1信号通路促进CAFs与上皮细胞生态位的形成，从而实现免疫逃逸
4. CAFs与上皮细胞生态位预测鳞状细胞癌的进展和预后

Summary

Para_01

1. 癌症的发展涉及癌细胞与其周围微环境的共同进化，但这种相互作用在物理结构中的动态过程仍知之甚少。
2. 在这里，我们展示了单细胞分辨率的空间转录组图谱，涵盖了来自43名患者的127个多阶段视野，以绘制人类食管鳞状细胞癌（ESCC）的进化轨迹。
3. 通过分析640万个细胞，我们揭示了ESCC的进展是由一种获得去分化和侵袭性特征的增殖上皮细胞亚群驱动的。
4. 在晚期癌前阶段，这些细胞破坏了上皮-基质界面，并通过JAG1-NOTCH1信号通路招募正常成纤维细胞，将其转化为癌症相关成纤维细胞（CAFs）。
5. 这种相互作用导致在肿瘤边缘形成了一种"CAF-Epi"（CAF和上皮细胞）生态位，该生态位可以保护肿瘤免受免疫监视。
6. CAF-Epi生态位的形成是ESCC及其他鳞状细胞癌进展的关键指标，也是患者预后的关键指标。

Graphical abstract

Keywords

• spatial transcriptomics; Xenium In Situ; cancer evolution; cancer-associated fibroblast; extracellular matrix remodeling; SPP1+ macrophage; regulatory T cell; immune escape; NOTCH1

Introduction

Para_01

1. 理解致癌过程中复杂的机制对于探索肿瘤进化和识别早期干预的目标至关重要。
2. 最近基因组学和单细胞转录组学的进步揭示了突变（如TP53、NOTCH1等）在肿瘤细胞中的关键作用
3. 以及上皮细胞和基质细胞群在推动癌变发展和进展中的复杂相互作用。
4. 然而，许多这些研究缺乏空间分辨率，限制了我们完全理解癌症细胞进化背后的分子机制和细胞间相互作用的能力。
5. 为了克服这一限制，需要进行高分辨率的空间转录组分析，以系统地绘制出致癌过程中细胞状态的空间动态变化。
6. Xenium In Situ 和 TF-seqFISH 平台已成为两种开创性的高通量技术，用于在大范围连续样本中对数百到数千个RNA靶标进行亚细胞定位。
7. 它们能够以前所未有的单细胞分辨率详细可视化和空间分析细胞结构和功能，因此代表了研究肿瘤空间进化理想工具。

Para_02

1. 食管鳞状细胞癌（ESCC）是进行这种时空癌症发生研究的理想模型系统。
2. 食管具有一个特征明确的空间结构，包括多层食管上皮基底层，该层容纳了响应于上皮更新的干细胞。
3. 在这之上，副基底层和表面层由处于不同分化阶段的细胞组成，形成了鳞状上皮的保护性外屏障。
4. 在上皮下方，成纤维细胞维持细胞外基质（ECM），提供结构支持，并分泌对伤口愈合和免疫细胞招募至关重要的生长因子、细胞因子和趋化因子。
5. ESCC 通过两个可识别的癌前病变进展：低级别和高级别上皮内瘤变（LGIN 和 HGIN），
6. 这两种病变可以通过活检采样，从而详细理解驱动 ESCC 进展的细胞和分子变化。

Para_03

1. 我们应用了Xenium In Situ和TF-seqFISH空间转录组学平台，在食管组织切片上检测了1,536个独特的基因，并整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，系统地捕捉食管鳞状细胞癌（ESCC）发展的连续阶段。
2. 这一策略使我们能够以前所未有的细节构建ESCC发展的单细胞分辨率多阶段空间图谱。
3. 与这张地图一起，我们开发了生物信息学方法，并进行了体外和体内功能实验，这些实验共同带来了对驱动ESCC发展的空间相互作用模式更深入的理解。
4. 因此，这项研究揭示了细胞状态的演变、空间组织及其相互作用如何驱动形成一个具有免疫抑制微环境的"CAF-Epi"（CAF和上皮细胞）生态位的过程，这个过程也在其他类型的鳞状细胞癌（SCC）中被观察到。
5. 这些全面的见解使得癌症进展的更准确分期成为可能，并提高了泛鳞状细胞癌患者预后的预测能力。

Results

Multi-stage spatial transcriptomic analysis reveals cell choreography in ESCC development

多阶段空间转录组学分析揭示了ESCC发展中细胞的协同作用

Para_01

1. 在这项研究中，我们对来自43名患者的总共127个视野（FOVs）进行了空间转录组学分析，这些患者代表了ESCC发展的多个阶段，包括45个正常食管上皮（NOR），25个轻度不典型增生（LGIN），21个重度不典型增生（HGIN）和36个ESCC视野（图1A；表S1）。
2. 我们从6名患者的整个食管组织中获得了71个视野（包括24个NOR，15个LGIN，16个HGIN和16个ESCC），每个视野涵盖了多个病理阶段，以便于评估疾病进展过程中细胞演化的连续性。
3. 为了确保我们的结果不受个别患者的影响，我们还分析了来自另外37名患者的56个视野（包括21个NOR，10个LGIN，5个HGIN和20个ESCC）。

图片说明 ◉ 图1 单细胞空间转录组学分析揭示了食管癌发生过程中的动态细胞群（A）本研究中食管鳞状细胞癌时空转录组学分析示意图。（B）UMAP图显示ESCC肿瘤发生过程中样品中的细胞群。（C）点图显示标记基因在不同细胞群中的标准化RNA水平。（D）代表性视野的空间转录组学图谱。（E）箱线图显示NOR（n = 45）、LGIN（n = 25）、HGIN（n = 21）和ESCC（n = 36）阶段每个视野中不同细胞群的平均密度。箱体表示中位数（中央线）和第25至75百分位数（箱体边界），须表示1.5倍四分位距。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验。另见图S1及表S1和S2。

Para_01

1. 空间转录组学分析使用了来自10×基因组学的Xenium In Situ平台，提供了单细胞分辨率分析，涉及6,442,006个细胞中的300个基因（参见STAR方法；表S2和图1A-1C）。
2. 我们还应用TF-seqFISH平台对另外两张包含NOR、LGIN和HGIN的组织切片进行了分析，以验证并通过Xenium In Situ空间转录组学分析来扩展结果，在21,999个细胞上检测了1,471个基因（参见STAR方法；表S2）。
3. 此外，我们整合了来自143个多阶段样本的scRNA-seq数据，总共包括385,151个细胞。
4. 这一全面的方法使我们能够详细研究食管鳞状细胞癌（ESCC）发展过程中的细胞状态和细胞间相互作用。

Para_02

1. 每个视野包含上皮细胞、基质细胞和免疫细胞的异质混合（图1D和S1）。
2. 我们计算了每个视野中每种细胞类型的密度，以评估ESCC发展中细胞结构的变化（图1E）。
3. 与NOR阶段的2.39相比，T细胞密度在LGIN阶段显著增加（3.60，p = 0.013），在HGIN阶段也显著增加（3.42，p = 0.035）。
4. 这表明在这些癌前病变阶段，免疫反应被激活了。
5. 然而，与HGIN阶段相比，ESCC阶段的T细胞密度显著下降（2.58，p = 0.044），表明ESCC微环境中的免疫状态从激活转向抑制。
6. 此外，我们发现HGIN阶段（4.54，p = 0.001）和ESCC阶段（5.36，p = 1.2e-6）的髓系细胞密度升高，而NOR阶段为3.17，这表明髓系亚型呈现促肿瘤分化。

Expansion of proliferative and invasive epithelial subpopulations drives ESCC development

增殖和侵袭性上皮亚群的扩展驱动了ESCC的发展

Para_01

1. 为了描绘肿瘤发生过程中上皮细胞的演变，我们描述了在ESCC发展过程中的多个阶段中包含的1,923,352个上皮细胞的4个主要亚群（图2A、S2A和S2B）。
2. 每个上皮细胞亚群表现出独特的表达谱，并通过多阶段样本的scRNA-seq数据进一步验证（图2B）。
3. 我们发现，在NOR阶段，分层的复层上皮保持完整，具有连续的基底膜，并且三个上皮细胞亚群位于其上方（图2C和S2C）。
4. 基底细胞（n = 80,065）表现出与去分化相关的表达程序（如ITGA6、NOTCH1和COL17A1）。
5. 增殖细胞（n = 126,560）表现为与细胞周期（如MYC、JAG1和TOP2A）、炎症（如STAT1、STAT3和HIF1A）和DNA修复（如DDB2、OGG1和RPA3）相关的通路上调（图2B）。
6. 在NOR阶段，对于上皮层再生至关重要的基底细胞和增殖细胞主要位于上皮-间质交界处附近（图2C和S2C），分别占上皮厚度的6.2%和7.2%（图S2D）。
7. 分化细胞（n = 281,285）具有参与粘膜防御的表达程序（如S100A8、ANXA1和TRIM29），形成保护屏障以抵御外部机械和化学损伤。
8. 这些细胞分散在整个上皮层中（图2C和S2C），平均占总上皮体积的86.7%（图S2D）。

图片说明 ◉ 图2。食管上皮细胞在整个食管鳞状细胞癌发展过程中的形态和转录进化（A）UMAP图显示了食管上皮细胞亚群（上图），以及不同阶段食管鳞状细胞癌发展中各亚群的比例（下图）。 ◉ （B）热图显示了不同阶段不同食管上皮细胞亚群中基因的标准化RNA水平（左图），以及气泡图显示了不同食管上皮细胞亚群中每个程序的标准化RNA水平（右图）。 ◉ （C）食管上皮结构的空间图，显示了上皮细胞之间的相对距离和上皮厚度（上图），以及不同阶段每个食管上皮细胞亚群相对于距离的核密度图（下图）。 ◉ （D）箱线图显示了不同阶段不同视野中八个程序的表达评分。箱子表示中位数（中央线）和第25至75百分位数（箱体限制），1.5倍四分位范围由须表示。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验得到p值。 ◉ （E）在HGIN中表达评分与上皮-间质界面的相对距离的相关性分析（上图），以及在ESCC中与肿瘤边缘的相对距离的相关性分析（下图）。使用Mann-Kendall趋势检验得到p值和r值。另见图S2。

Para_01

1. 在LGIN阶段，增殖细胞从NOR阶段的7.2%扩展到22.2%（p = 9.7e-7；图S2D），同时伴随着与NOR阶段相比，细胞周期（p = 5.5e-3）、炎症（p = 8.7e-3）和DNA修复（p = 0.017）程序的显著上调（图2D）。
2. 相反，分化上皮细胞的平均比例厚度从NOR阶段的86.7%减少到60.1%（p = 9.7e-7）（图S2D）。
3. 尽管差异不具有统计学意义（p = 0.220；图2D），粘膜防御程序的表达水平也低于NOR阶段。
4. 这些变化表明，LGIN进展的特点是增殖细胞亚群向食管腔方向显著扩张，压缩了分化细胞区域。

Para_02

1. 在HGIN阶段，增殖和侵袭性上皮细胞迁移到了它们的原生区域之外，主导了上皮景观，取代了基底细胞并压缩了分化细胞域（图2C和S2C）。
2. 从增殖细胞中出现侵袭性细胞（n = 58,817）是一个显著事件（图S2B）。
3. 这些细胞表现出上皮间质转化（EMT，例如MMP2、MMP11和CXCL12）、致癌转录因子（TFs，例如SOX2、TP63和TP73）、血管生成（例如SPP1、VEGFA和VEGFC）以及去分化的基因表达显著升高（图2B）。
4. 这种增殖和侵袭性细胞的扩张通过它们在HGIN阶段的平均细胞比例分别为37.3%和18.5%得以证明（图S2E），并且涉及EMT（p = 2.4e-3）、致癌TFs（p = 1.3e-4）和血管生成（p = 5.2e-6）的基因表达水平更高（图2D）。
5. 然而，在这种癌前病变中，分化细胞的平均比例厚度从LGIN阶段的60.1%减少到34.9%（p = 7.1e-3；图S2D），与正常组织相比，粘膜防御程序的表达显著降低（p = 8.3e-6；图2D）。
6. 此外，我们在16个视野中的4个中发现，上皮细胞穿透了上皮-基质界面形成侵袭前沿，尽管其他区域仍然保持完整的界面（图2C）。
7. 在HGIN阶段，侵袭前沿包含比其他区域更高的侵袭性细胞比例（68.5%对比12.3%；图S2F），这表明侵袭性细胞可能在破坏上皮-基质界面中起作用。

Para_03

1. 在ESCC阶段，我们发现基底-间质界面完全破坏，侵袭性细胞亚群的比例显著增加到79.3%，而在HGIN阶段仅为18.5%（p = 7.5e-8；图S2E）。
2. 侵袭性细胞位于肿瘤边缘，并完全侵入间质区域（图2C）。
3. 与HGIN阶段相比，ESCC阶段涉及上皮间质转化（EMT）（p = 9.9e-5）、血管生成（p = 9.3e-3）和去分化（p = 2.3e-5）的基因表达水平显著升高（图2D）。
4. 这些侵袭性特征通过额外的人体组织样本的免疫荧光染色进一步得到证实（图S2G）。
5. 此外，分化细胞主要位于肿瘤核心（图2C），并且其比例从HGIN阶段的29.4%显著下降到ESCC阶段的4.8%（图S2E）。
6. 综合以上结果表明，获得的侵袭性和去分化可能驱动了从LGIN阶段局部扩展到HGIN和ESCC阶段向间质区域的侵袭。

Para_04

1. 此外，我们发现，在HGIN处靠近上皮-间质边界的位置和在ESCC阶段靠近肿瘤边缘的位置，上皮细胞中去分化、细胞周期、EMT和致癌转录因子相关的显著增加趋势（所有p < 2.2e-16；图2E）。
2. 体外侵袭实验表明，与NOR类器官相比，HGIN和ESCC类器官具有显著增强的侵袭能力（p = 0.017 和 p = 8.9e-5），而NOR和LGIN类器官之间的侵袭能力没有显著差异（p = 0.191；图S2H）。
3. 与侵袭能力一致，HGIN和ESCC类器官中侵袭性细胞标记物的水平显著增加，包括EMT通路中的Mmp2和Mmp11、致癌转录因子Nfe2l2、Sox2和Trp63、血管生成因子Vegfa和Vegfc以及去分化的基因Notch1和Col17a1（所有p < 0.05；图S2I）。
4. 这些结果进一步突显了恶性上皮细胞获得侵袭性和去分化的能力，从而推动ESCC的发展。

Epithelial invasiveness and dedifferentiation are indicators of ESCC progression

上皮浸润和去分化是ESCC进展的指标

Para_01

1. 通过使用TF-seqFISH测定方法，我们发现上皮细胞的4个亚群的空间分布和表达模式变化被一致识别（图3A、3B、S3A和S3B）。
2. 然后，我们根据上皮亚群的进化模式开发了独立的上皮侵袭性和去分化评分（见STAR方法，图S3C-S3J）。
3. 在我们的单细胞RNA测序数据中，我们揭示了随着疾病进展到HGIN和ESCC阶段，侵袭性和去分化评分都有显著增加（图3C）。
4. 我们的Xenium原位数据显示，增殖和侵袭性细胞扩张驱动了这一趋势，两者均显示出最高的上皮侵袭性评分，而侵袭性细胞表现出最高的去分化评分（图3D）。
5. 值得注意的是，在NOR/LGIN阶段，增殖细胞的去分化评分低于基底细胞，但在HGIN和ESCC阶段接近基底细胞的数值，这支持了去分化水平是关键进展标志的观点（图3E）。
6. 我们进一步确认，具有相对较高侵袭性和去分化评分的上皮细胞定位在NOR和LGIN阶段的基底层和增殖区，但在HGIN和ESCC阶段扩展至整个病变区域（图3F）。
7. 因此，上皮细胞的中位侵袭性评分从NOR阶段的0.46增加到LGIN、HGIN和ESCC阶段的0.60、0.67和0.69（图3G）。
8. 同时，中位去分化评分在整个ESCC发展中也有所上升（图3G）。
9. 总体而言，这些发现表明食管上皮从分化状态向更去分化和侵袭性状态的转变是ESCC进展的关键指标。

图片说明 ◉ 图3 肿瘤增殖分化细胞向去分化细胞的转变标志着食管鳞状细胞癌的发展（A）使用TF-seqFISH平台检查的两个组织切片（S47和S48）的DAPI图像（左图）和空间图（右图）。比例尺：100 μm。（B）显示不同上皮细胞亚群中途径基因集富集分析（GSVA）Z分数的散点图。 ◉ （C）展示scRNA-seq数据中NOR（n = 95）、LGIN（n = 28）、HGIN（n = 1,053）和ESCC（n = 2,002）阶段上皮侵袭评分（上图）和去分化评分表达（下图）的小提琴图。中央线表示中位数。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s事后检验得出p值。（D）展示Xenium In Situ数据中不同阶段不同上皮细胞亚群上皮侵袭评分（上图）和去分化评分（下图）的核密度图。 ◉ （E）展示所有患者在相关疾病阶段基底细胞、增殖细胞和侵袭细胞去分化评分的小提琴图（上图）。下图描绘了两名单独患者的增殖细胞和基底细胞模式。中央线表示中位数。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s事后检验得出p值。（F）代表性上皮结构的HE染色图像（左图）和空间图（右图）。 ◉ （G）展示NOR（n = 24）、LGIN（n = 15）、HGIN（n = 16）和ESCC（n = 16）阶段上皮侵袭评分（上图）和去分化评分（下图）的箱线图。箱体表示第25至75百分位数（箱体边界），中位数由中央线表示，须表示1.5倍四分位距范围。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s事后检验得出p值。另见图S3。

CAF-Epi niche formation by invasive epithelial cells and nearby CAFs from HGIN stage

侵袭性上皮细胞和邻近的CAF形成HGIN阶段的CAF-Epi小生境

Para_01

1. 我们随后使用标记基因PI16、DPT、DCN量化了正常成纤维细胞（NFs）的密度，并使用标记基因FAP、MMP1、MMP11和POSTN在整个疾病连续体中量化了癌相关成纤维细胞（CAFs）的密度（图4A和S4A）。
2. NF密度在LGIN、HGIN和ESCC样本中保持稳定，并广泛分布，在肌肉层中丰富。
3. CAFs密度在NOR（0.12）和LGIN（0.15）中较低，但在HGIN中激增（0.65），并在ESCC中占据主导地位（5.77；图4B）。
4. 此外，我们的结果显示，在ESCC阶段，CAFs距离上皮细胞的平均距离为27.3 μm，显著大于HGIN阶段的20.3 μm（图4C），这表明ESCC阶段扩展的侵袭性上皮细胞可能对将NFs转化为CAFs产生更远和更广泛的效应。
5. 然后，我们在单细胞分辨率下检查了上皮细胞与成纤维细胞之间的空间细胞-细胞相互作用（见STAR方法；图4D）。
6. 我们将距离上皮细胞每10 μm处总成纤维细胞中的CAFs比例进行了比较，并显示当靠近上皮细胞的距离从91-100 μm缩小到1-10 μm时，CAFs的比例显著增加（HGIN阶段p = 2.3e–4，ESCC阶段p = 1.7e–7；图4E）。
7. 此外，使用scRNA-seq数据进行的细胞-细胞通讯分析揭示了从侵袭性上皮细胞到CAFs的相互作用明显强于分化细胞（图S4B）。
8. 这些结果表明，在HGIN阶段出现的侵袭性上皮细胞已经可以激活NFs成为CAFs。

图片说明 ◉ 图4。侵袭性上皮细胞和附近CAF在HGIN和ESCC阶段形成的CAF-Epi生态位（A）显示标记基因在NFs和CAFs中的标准化RNA水平的点图。（B）显示不同阶段每个视野中NFs和CAFs的平均密度的箱线图。框显示中位数（中央线）和第25至第75百分位数（框限），1.5倍四分位距由须表示。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s事后检验得到p值。（C）显示HGIN和ESCC阶段NFs或CAFs与上皮细胞距离的小提琴图。中心线表示中位数。（D）显示纤维母细胞和上皮细胞空间接近度定量的示意图。（E）显示在HGIN（16个视野）和ESCC（16个视野）阶段通过距离组识别出的NFs和CAFs比例的堆积条形图。Mann-Kendall趋势检验得到p值。（F）显示11种细胞邻域簇中10种细胞类型比例的热图。TLS，三级淋巴结构。（G）代表幻灯片（S1-2）中11种细胞邻域分布的空间图。（H和I）显示不同阶段每个视野中每个细胞邻域簇比例的箱线图。框显示中位数（中央线）和第25至第75百分位数（框限），1.5倍四分位距由须表示。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s事后检验得到p值。（J）ESCC和HNSC中代表性CAF-Epi生态位的空间地图。另见图S4和表S3。

Para_01

1. 我们随后对整个食管鳞状细胞癌（ESCC）发展过程中的细胞群进行了细胞邻域分析。
2. 结果显示了一个由CAFs和侵袭性上皮细胞组成的独特细胞区室，我们将其称为CAFs-上皮（CAFs-Epi）微环境（图4F-4I）。
3. 该微环境在高度异型增生（HGIN）的侵袭前沿和ESCC的肿瘤边缘被识别出来（图4G），在ESCC中观察到的比例显著高于HGIN（p = 7.7e-5）（图4I）。
4. 值得注意的是，微环境内的CAFs表现出更高的激活状态，与外界相比，FAP、MMP11和POSTN的上调显著（所有p < 0.05；图S4C）。
5. 此外，我们还获得了来自头颈鳞状细胞癌（HNSC）样本的Xenium空间数据，发现在肿瘤中有多个CAFs-Epi微环境（图4J）。
6. 这些结果表明，CAFs-Epi微环境的形成可能是鳞状细胞癌（SCC）进展的关键特征。

Invasive epithelial cells drive the CAF-Epi niche formation through JAG1-NOTCH1 signaling

侵袭性上皮细胞通过JAG1-NOTCH1信号传导驱动CAF-Epi微环境的形成

Para_01

1. 我们随后调查了侵袭性细胞与CAFs之间的相互作用如何促进了CAFs-上皮生态位的形成。
2. 在靠近侵袭性细胞的NFs中观察到了CAFs激活标志物（即FAP、MMP1、MMP11和POSTN）表达水平的增加趋势（所有p < 0.001；图S4D），这表明NFs离侵袭性细胞越近，就越有可能被激活为CAFs。
3. 此外，我们发现侵袭性上皮细胞的循环（p < 2.2e–16）和去分化（p < 2.2e–16）程序随着它们与CAFs的空间距离从150 μm减少到1 μm，在ESCC阶段逐步上调（图S4E），包括两个关键基因JAG1（p < 2.2e–16）和NOTCH1（p < 2.2e–16；图S4F）。
4. 共培养永生化食管鳞状细胞系（Het1A）或细胞系（KYSE510）与CAFs显示显著增高的增殖率（分别为p = 6.4e–3和p = 1.8e–6；图S4G）以及NOTCH1、MYC、AURKA、SPP1、SOX2和TP63的表达水平升高（所有p < 0.01；图S4H），相比与NFs共培养的情况。
5. 另一方面，与KYSE510细胞共培养的CAFs表现出显著更高的增殖率（p = 0.019）、迁移能力（p = 0.028）以及CAFs激活标志物（FAP、VIM和αSMA）的蛋白表达水平，相比与Het1A细胞共培养的情况（图S4I-S4K）。
6. 这些结果表明，侵袭性上皮细胞和CAFs的空间共定位在促进和维持CAFs-上皮生态位的形成中起着关键作用，甚至早在HGIN阶段就开始了。

Para_02

1. JAG1和NOTCH1主要在HGIN和ESCC阶段的增殖和侵袭细胞中表达（图S5A）。
2. JAG1与NOTCH1的结合导致了NOTCH1胞内域（NICD）的释放，这促进了趋化因子下游转录的激活，可能促进NFs的募集和激活。
3. 我们的先前单细胞转录组研究揭示，在食管样本中，三种趋化因子CXCL1、CXCL8和CCL20相对高表达，并且在HGIN阶段上皮细胞中的表达显著上调（p = 7.1e-4、1.9e-3和3.4e-3，分别）以及在ESCC阶段（p = 1.3e-4、2.1e-3和1.8e-3，分别）相比NOR（图S5B）。
4. 在这三种趋化因子中，只有CXCL1和CXCL8（而不是CCL20）在JAG1扰动后显著改变（图S5C-S5F）。
5. 共免疫沉淀产物的western blotting验证表明，在ESCC细胞中，JAG1过表达后，NICD1与其辅助因子CSL的结合显著增加（图S5G）。
6. 染色质免疫沉淀耦合定量PCR分析显示，在KYSE510细胞中，JAG1过表达显著增强了NICD1与CXCL1（p = 0.008）和CXCL8（p = 0.025）启动子的结合，与对照组相比。

Para_03

1. 我们随后检查了上皮JAG1-NOTCH1信号传导在ESCC发展过程中招募和激活CAFs的效果。
2. 多重免疫荧光分析显示，在ESCC发展中JAG1水平增加，得分与ESCC癌巢或邻近间质的上皮层中的CAF标记物αSMA（r = 0.57，p = 7.3e-14）和FAP（r = 0.53，p = 6.1e-12）呈正相关，这与Xenium In Situ数据一致（图5A和S5I）。
3. 我们的小鼠食道scRNA-seq分析显示，用致癌物4-硝基喹啉1-氧化物（4-NQO）处理的小鼠食道诱导了多阶段ESCC病变，也揭示了JAG1表达和CAF评分（Acta2、Mmp11和Cthrc1）之间存在相关性（r = 0.66，p = 0.024），并且在ESCC发展中呈现上升趋势（图5B和5C）。
4. 此外，来自人食道组织的空间转录组数据显示，在ESCC进展过程中，上皮细胞附近的CAF评分升高（图5D）。
5. 因此，我们将ESCC细胞与从人食道组织中提取的NFs共培养，结果显示，与控制ESCC细胞共培养的NFs相比，与JAG1过表达的ESCC细胞共培养的NFs表现出显著更高的迁移能力（p = 1.2e-14），而当NFs与JAG1沉默的ESCC细胞共培养时，结果相反（p = 3.7e-13和p = 9.2e-13；图S6A）。
6. 有趣的是，当在JAG1过表达的ESCC细胞中敲低CXCL1或CXCL8时，共培养的NFs的迁移能力不再增加（图S6B）。
7. CAF活化标记物（胶原I、FAP、αSMA和IL6）在与JAG1过表达的ESCC细胞共培养的NFs中升高，而在与JAG1沉默的ESCC细胞共培养的NFs中保持不变，与对照组相比（图S6C）。
8. 综合来看，这些结果表明，上皮细胞中升高的JAG1-NOTCH1信号传导在招募和激活CAFs中起重要作用。

图片说明 ◉ 图5。JAG1-NOTCH1信号通路促进癌症相关成纤维细胞的招募和激活(A) 多重免疫荧光分析（左图）和空间转录组学图谱（右图）显示了不同阶段的JAG1和CAF活化标志物FAP和αSMA。 ◉ (B) 线图显示NOR（n = 3）、LGIN（n = 2）、HGIN（n = 2）和ESCC（n = 4）各阶段的Jag1 RNA水平和CAF评分趋势。数据显示中位数。 ◉ (C) 鼠类scRNA测序数据中Jag1水平与CAF评分之间的斯皮尔曼相关性（C）。通过斯皮尔曼相关性检验得到p值和r值。 ◉ (D) 代表性NOR、LGIN、HGIN和ESCC区域的空间图显示HE染色（左图）和CAF评分水平（右图）。比例尺：500 μm。 ◉ (E) 遗传工程小鼠食管上皮特异性Notch1条件敲除诱导食管前癌病变和ESCC的示意图（上图）和HE图像（下图）。比例尺：1,000 μm。 ◉ (F) 条形图显示按基因型划分的LGIN、HGIN和ESCC网格比例（每组n = 5）。数据为平均值 ± SEM。通过Kruskal-Wallis检验后进行Dunn's事后检验得出p值。 ◉ (G) 在不同阶段的鼠食管样本中对NICD、JAG1和CAF活化标志物FAP和αSMA进行多重免疫荧光分析。比例尺：100 μm。 ◉ (H) 线图（左上图）显示Notch1+/+小鼠在NOR（n = 4）、LGIN（n = 7）、HGIN（n = 6）和ESCC（n = 4）各阶段的NICD、JAG1、FAP和αSMA表达水平的趋势及斯皮尔曼相关性（右上图）显示增殖和CAF评分之间的关系。通过斯皮尔曼相关性检验得到p值和r值。 ◉ 条形图（下图）显示Notch1+/+（n = 6）、Notch1+/−（n = 10）和Notch1−/−（n = 6）小鼠食管样本中的NICD、JAG1、FAP和αSMA的IF评分。数据为平均值 ± SEM。通过Kruskal-Wallis检验后进行Dunn's事后检验得出p值。参见图S5和表S3。

Para_03

1. 我们建立了食管上皮特异性Notch1敲除小鼠，并用4-NQO处理以诱导多阶段ESCC病变（见STAR方法）。
2. 我们将小鼠食管组织的苏木精和伊红染色切片分区，并将其划分为100微米乘100微米的区域，以定量评估每只小鼠（n = 5；图5E和S6D）中各种病变的比例。
3. 在小鼠中删除Notch1导致ESCC病变发生率显著降低，Notch1⁻/⁻小鼠显示出最少的侵袭性区域（图5F）。
4. 多重免疫荧光确认了上皮Notch1信号促进CAF激活，因为JAG1和NICD1水平随着疾病进展逐步增加，并且与CAF标记物（FAP和αSMA）呈正相关（图5G、5H和S6D–S6F）。
5. 我们还建立了由4-NQO诱导的Notch1条件敲除小鼠中的ESCC来源的类器官，并通过多重免疫荧光和qPCR分析发现Notch1+/−（p = 1.0e-11和p = 0.002）和Notch1−/−（p < 2.2e-16和p = 4.8e-6）小鼠中的Cxcl1水平显著低于Notch1+/+小鼠（图S6G和S6H）。
6. 总之，这些发现强烈表明CAF-Epi生态位的形成驱动ESCC进展，而JAG1-NOTCH1信号抑制可防止其发展。

The CAF-Epi niche forms an immune-sequestration microenvironment in the tumor region

CAF-Epi 小生境在肿瘤区域形成免疫隔离微环境

Para_01

1. 为了阐明CAF-Epi生态位形成的免疫后果，我们系统地分析了ESCC进展过程中上皮和间质区域免疫细胞的空间分布（图6A-6C和S7A-S7C）。
2. 在上皮-间质交界线以上的上皮区域，我们观察到单核细胞密度略有增加（0.61对1.00，p = 0.381），树突状细胞（0.12对0.52，p = 0.177）以及CD8+和CD4+初始/记忆T细胞（0.61对0.83，p = 0.115和0.55对0.79，p = 0.060）从NOR到LGIN阶段有所增加（图6A、6C和S7C）。
3. 在间质区域，除三级淋巴结构（TLS）的比例有所增加外，免疫细胞密度没有显著变化，从NOR阶段的45个视野中的12个（26.7%）增加到LGIN阶段的25个视野中的9个（36.0%）。
4. 这些结果表明，在NOR和LGIN阶段存在一种积极的免疫反应，旨在抵御ESCC的进展。

图片说明 ◉ 图6。CAF-Epi小生境的形成建立了肿瘤区域中的免疫隔离微环境（A）散点图显示了不同阶段每个视野上皮区（上图）和间质区（下图）中免疫细胞亚型的平均密度。（B）热图显示了不同距离到上皮-间质界面（HGIN）或肿瘤边缘（ESCC）的CAFs和SPP1+巨噬细胞（上图），CD8+和CD4+T细胞（下图）的平均密度。左图来自HGIN阶段，右图来自ESCC阶段。（C）代表CAF-Epi小生境和不同类型免疫细胞分布的空间图。（D和F）ECM评分与ESCC（D）和HNSC（F）样本中肿瘤边缘距离的相关性分析。左图显示了ECM评分和CAF-Epi小生境的空间图。右图是ECM评分与肿瘤边缘距离之间的相关曲线。p值和r值通过Mann-Kendall趋势检验。（E和G）ESCC（E）和HNSC（G）样本的HE染色和多重免疫荧光图像，显示EPCAM、CAF激活标志物αSMA和FAP以及ECM成分I型胶原和III型胶原。比例尺，500μm。另见图S6和S7以及表S3。

Para_01

1. 在HGIN阶段的上皮区域，CD4+调节性T细胞（Tregs）的密度显著升高，与正常组织（NOR）相比（0.77比0.08，p = 3.9e-7），增殖评分也显著增加（通过平均MKI67、AURKA、CCDN1和CCNA2的表达水平；p = 2.2e-5；图6A、6C、S7C和S7D）。
2. 相比之下，与正常组织（NOR）相比（0.43比0.61，p = 0.018；图6A、6C和S7A），HGIN阶段的CD8+幼稚/记忆T细胞密度降低。
3. 此外，与正常组织阶段（NOR）的0.02相比，HGIN阶段上皮区域内的肿瘤促进SPP1+巨噬细胞的密度增加（0.19，p = 5.6e-5），并且增殖评分也有显著增加（p = 0.016；图6A、6C、S7C和S7D）。
4. 在HGIN阶段的间质区域，TLS的存在比例增加（15/21个视野，71.4%）与低级别上皮内瘤变（LGIN）的36.0%和正常组织（NOR）的26.7%相比。
5. 这些发现表明，尽管免疫反应在HGIN阶段是活跃的，但在这一晚期癌前阶段，上皮区域可能开始出现向免疫抑制的转变，并且伴随巨噬细胞向促肿瘤表型的分化。

Para_02

1. 在ESCC中，观察到了免疫细胞分布更加剧烈的变化。
2. 与正常组织（NOR）相比，ESCC阶段肿瘤区域的CD4+和CD8+幼稚/记忆T细胞以及树突状细胞密度显著降低（0.55比0.24，p = 0.001；0.62比0.08，p = 2.6e-7；0.12比0.03，p = 0.003；图6A、6C和S7C所示）。
3. 此外，我们注意到ESCC阶段肿瘤区域的CD8+ Tex细胞密度显著升高（0.33比0.10，p = 0.004），增殖分数也显著增加（p = 0.043；图6A、6C、S7C和S7D所示）。
4. 此外，ESCC阶段肿瘤区域内的SPP1+巨噬细胞密度显著增加至0.65（p = 4.0e-13），而正常组织中仅为0.02，同时增殖分数也显著提高（p = 0.004；图6A、6C、S7C和S7D所示）。
5. 这些发现表明，在晚期ESCC阶段建立了一个免疫抑制和耗竭的微环境，这伴随着肿瘤区域巨噬细胞向促肿瘤分化的发展。

Para_03

1. 我们随后调查了免疫变化是否与CAF-Epi生态位的形成有关。
2. 细胞邻域分析显示，在食管鳞状细胞癌（ESCC）阶段，SPP1阳性巨噬细胞和CAF-Epi生态位在肿瘤区域显著共定位（图S7E）。
3. 此外，使用单细胞RNA测序数据分析发现，CAF与SPP1阳性巨噬细胞之间增强了极化或粘附相关的配体受体对，包括先前已知的RARRES2-CMKLR1,47,48,49，而与正常纤维细胞（NFs）和SPP1阳性巨噬细胞相比（图S7F）。
4. 这些结果表明，CAF-Epi生态位的形成可能促进SPP1阳性巨噬细胞在从高度异型增生（HGIN）到ESCC阶段过渡期间的分化。

Para_04

1. 此外，细胞密度分析显示，在高度异型增生（HGIN）和食管鳞状细胞癌（ESCC）中，上皮-间质交界处周围富集了CAF-Epi生态位和SPP1阳性巨噬细胞，并且在ESCC中CAF和SPP1阳性巨噬细胞的密度更高（图6B和6C）。
2. 在HGIN中，CD4+和CD8+T细胞（不包括CD4+调节性T细胞）的密度在上皮区域以及距离上皮-间质交界处100微米内的区域显著低于在超过100微米的间质区域（图6B）。
3. 而在ESCC中，在肿瘤区域内以及超出肿瘤边界250微米范围内识别出一个免疫空洞区（图6B）。
4. 这些空间分布表明，肿瘤边缘的CAF-Epi生态位可能形成了一道屏障，损害了肿瘤防御中的免疫细胞功能。
5. 因此，我们研究了这种屏障是否由CAF-Epi生态位形成过程中诱导的细胞外基质（ECM）重塑所导致。
6. 我们发现，在肿瘤边缘CAF-Epi生态位周围的高ECM评分（通过COL1A1、COL1A2和COL3A1表达的平均值计算得出）有所增加（图6D）。
7. 在间质区域，我们观察到随着接近肿瘤边缘的距离从0到250微米，ECM评分显著下降（r = -0.86, p < 2.2e-16；图6D）。
8. 在上皮区域，随着接近肿瘤边缘的距离从0到50微米，也观察到了类似的下降趋势（r = -0.53, p = 3.2e-8；图6D）。
9. 这些结果表明，在肿瘤边缘CAF-Epi生态位周围形成了密集的纤维化ECM。
10. 此外，通过多路免疫荧光分析确认了上皮细胞（EPCAM）、CAF（FAP和αSMA）以及ECM（I型胶原和III型胶原）标记基因，进一步证实了这一ECM重塑现象（图6E）。
11. 此外，我们在头颈部鳞状细胞癌（HNSC）中也发现了类似的CAF-Epi生态位以及它诱导的ECM重塑（图6F和6G），这表明这种生态位通过ECM重塑促进在多种鳞状细胞癌中建立免疫隔离微环境。

Clinical potential of epithelial and microenvironmental remodeling scores in ESCC and other SCC

上皮和微环境重塑评分在ESCC及其他SCC中的临床潜力

Para_01

1. 我们随后系统地评估了CAF-Epi生态位在ESCC发展中的临床相关性。
2. 我们通过平均FAP、MMP1、MMP11、POSTN、COL1A1、COL1A2和COL3A1的表达水平得出了一个CAF评分，并测试了其预测价值，独立于或与已建立的上皮侵袭评分结合，用于ESCC进展的预测（图7A）。
3. 上皮侵袭评分在NOR时为0.70，在HGIN时显著增加至0.82（p = 4.4e-10），在ESCC时进一步增加至0.98（p < 2.2e-16；图7B）。
4. CAF评分在NOR和LGIN时分别为1.09和1.12。
5. 与NOR相比，该评分在HGIN时显著增加至1.31（p = 0.003），并在ESCC时进一步增加至1.62（p = 3.0e-10；图7B）。
6. 值得注意的是，整合的CAF-Epi生态位评分结合了上皮侵袭评分和CAF评分，在NOR（0.85）、HGIN（1.02，p = 5.3e-8）和ESCC（1.15，p < 2.2e-16；图7B）中显示出递增趋势。
7. 此外，我们发现JAG1的表达水平与CAF评分之间存在显著相关性（r = 0.16，p = 0.024；图S7G），证实了CAF激活是由JAG1-NOTCH1信号驱动的。
8. 利用多路免疫荧光分析在额外队列中，我们确认了ESCC（n = 48）、HNSC（n = 66）、肺鳞状细胞癌（LUSC，n = 80）和宫颈鳞状细胞癌（CESC，n = 94；图7C）样本中CAF-Epi生态位的形成。
9. 综上所述，与CAF-Epi生态位形成相关的基因可能作为多种SCC进展的重要指标。

图片说明 ◉ 图7。上皮侵袭性和CAF评分与ESCC进展和pan-SCC预后相关（A和B）显示与侵袭性细胞和CAFs相关的基因蛋白表达水平的热图（A）以及展示上皮侵袭性评分、CAF评分和CAF-Epi生态位评分在蛋白水平上的箱线图（B），样本分别处于NOR（n = 114）、LGIN（n = 206）、HGIN（n = 259）和ESCC（n = 207）阶段。箱形图显示中位数（中央线）和第25至第75百分位数（箱体界限），用1.5倍四分位范围表示的须。 p < 0.05； p < 0.01； p < 0.001；p值由Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验得出。（C）ESCC、HNSC、LUSC和CESC样品中标记基因的多光谱免疫荧光：CAFs（FAP和αSMA）和侵袭性上皮细胞（JAG1和EPCAM）。比例尺，100 μm。（D）基于CAF-Epi-Immune评分的训练队列（左面板，n = 179）、验证队列（中面板，n = 137）和联合队列（右面板，n = 316）中ESCC患者的总体生存率Kaplan-Meier曲线。根据CAF-Epi-Immune评分的中位数将患者分为高表达组和低表达组。p值通过对数秩检验得出。风险比（HR）使用Cox回归估计，并给出95%置信区间（CI）。（E）根据TNM分期对ESCC联合队列（n = 316）中ESCC患者的危险评分。箱形图显示中位数（中央线）和第25至第75百分位数（箱体界限），用1.5倍四分位范围表示的须。p值通过双侧t检验得出。（F和G）来自TCGA数据库的SCC患者的总体生存率Kaplan-Meier曲线（F），包括TCGA-HNSC队列（左面板，n = 545）、TCGA-LUSC队列（中面板，n = 542）和TCGA-CESC队列（右面板，n = 296）以及联合SCC队列（G，n = 1,699）。根据CAF-Epi-Immune评分的中位数将患者分为高表达组和低表达组。p值通过对数秩检验得出。HR使用Cox回归估计，并给出95% CI。另见图S7。

Para_01

1. 我们接下来研究了CAFs-上皮细胞（CAFs-Epi）微环境在鳞状细胞癌（SCC）中的预后潜力及其诱导的免疫微环境重塑。
2. 我们通过最小绝对收缩和选择算子（LASSO）Cox回归分析了179名食管鳞状细胞癌（ESCC）患者的36个与预后相关的细胞基因，构建了一个预后预测模型（发现队列；图S7H），确定了一个由26个基因组成的"CAFs-Epi-免疫"评分，该评分与ESCC的预后密切相关（p = 0.046；图7D）。
3. 在独立的137名ESCC患者队列（验证队列）中进一步确认了这一评分的预后效用，结果显示评分较高与较差的总体生存率相关（p = 5.7e–8；图7D）。
4. 当将发现队列和验证队列合并后，在316名ESCC患者中观察到类似的趋势（p = 3.4e–7；图7D），并且较高的评分与更晚期的肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期（III和IV期）相比早期阶段（I和II期）的相关性更强（p = 2.0e–8；图7E）。
5. 与单独的上皮侵袭评分（0.747）或CAFs评分（0.720）相比，CAFs-Epi-免疫评分在ESCC患者预后预测中的曲线下面积（AUC）更高（0.786；图S7I）。
6. 尽管这一评分的AUC高于TNM（0.786比0.722；图S7I），但在对数似然比检验中并未显示出超出TNM的额外预后价值（p = 0.085），这表明它主要反映了ESCC的进展。
7. 我们还评估了这一评分在癌症基因组图谱（TCGA）数据库中其他类型SCC中的预后价值，包括头颈鳞状细胞癌（HNSC，n = 545）、肺鳞状细胞癌（LUSC，n = 542）和宫颈鳞状细胞癌（CESC，n = 296）。结果显示，评分较高与HNSC（p = 0.003）、LUSC（p = 0.025）和CESC（p = 6.7e–5；图7F）的不良预后显著相关。
8. 在对1,699份SCC样本的综合分析中，我们进一步证实了高评分与较差预后风险增加之间的显著关联（HR = 1.74，95% CI：1.60–1.89，p = 2.4e–9；图7G）。这些发现突显了CAFs-Epi微环境在泛SCC中的潜在预后意义。

Discussion

Para_01

1. 空间转录组学通过整合定义形态内的高通量分子数据，彻底改变了肿瘤生态系统的研究。
2. 然而，以前的技术面临分辨率挑战，通常会捕捉到多个细胞群体的信号。
3. 在这里，我们应用了两种先进技术来解读食管鳞状细胞癌的肿瘤发生过程，揭示了关键的细胞相互作用和进化轨迹。
4. 一个重要的发现是，JAG1-NOTCH1驱动CAF-Epi生态位的形成，这重塑了肿瘤微环境，并促进了免疫逃逸。

Para_02

1. 先前的研究表明，食管鳞状细胞癌可能起源于基底层中平衡偏向于增殖而非分化的食管上皮祖细胞。然而，缺乏直接的人体组织证据。我们的多阶段空间进化图鉴定了在食管鳞状细胞癌发展过程中发挥不同作用的四种上皮细胞亚群。从正常到低级别上皮内瘤变，增殖细胞向管腔扩展，同时保持上皮结构。在高度不典型增生中，侵袭性细胞出现，突破上皮-间质界面，并获得多种癌症特征。此外，这些细胞的分化程度低于低级别上皮内瘤变的增殖细胞，类似于基底细胞，这表明肿瘤进展是由去分化或干细胞样群体的选择驱动的。上皮细胞的进化及其异常相互作用也可能由TP53失活及其诱导的基因组改变驱动，这些改变在关键的癌症相关通路（如细胞周期、上皮-间质转化和致癌转录因子）中引发级联效应。

Para_03

1. 上皮细胞与成纤维细胞的相互作用是CAF-Epi微环境形成的核心。
2. 我们之前的单细胞RNA测序分析表明，在HGIN和ESCC阶段，转化的上皮细胞可以通过减弱的串扰激活NFs成为CAFs。
3. 虽然已经提出了这种过程的遗传驱动因素，但上皮细胞在ESCC发展中招募和激活NFs/CAFs的空间范围和详细机制仍然未知。
4. 在这里，我们提供了直接证据，证明从HGIN阶段开始就存在CAF-Epi微环境，在此过程中破坏上皮基质边界使侵袭性上皮细胞和CAF相互作用。
5. 值得注意的是，JAG1-NOTCH1及其下游的CXCL1和CXCL8介导了上皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用和共同进化。
6. 此外，CAF-Epi微环境可能促进CD4+ Tregs和SPP1+巨噬细胞的分化，从而在HGIN和ESCC阶段促进免疫抑制。
7. 肿瘤边缘CAF-Epi微环境的形成还诱导ECM重塑，这建立了一道阻碍免疫细胞防御肿瘤能力的屏障。
8. 值得注意的是，我们在多种SCCs中发现了CAF-Epi微环境的存在，这表明存在一种泛SCC免疫逃逸机制，并代表了肿瘤‘最后一道防线’的丧失。

Para_04

1. 重要的是，我们的研究发现具有重要的临床应用潜力。
2. 目前，食管鳞状细胞癌（ESCC）和前体病变的诊断依赖于内镜检查和组织病理学，但这种方法未能充分捕捉疾病进展，并缺乏预后精确性。
3. 我们的研究发现表明，一个综合的CAF-Epi-免疫评分，反映了侵袭性、去分化表型的同时获得以及基质-免疫改变，可以作为ESCC进展的指标，并与ESCC和其他SCC患者的预后相关。
4. 这些发现突显了将CAF-Epi生态位评估整合到SCC临床评估中的必要性。

Para_05

1. 总之，本研究描绘了食管鳞状细胞癌（ESCC）发展过程中多阶段的空间细胞演变和分子机制轮廓，阐明了JAG1-NOTCH1驱动的上皮重塑和CAF招募作为CAV-上皮生态位形成的关键过程。
2. 这些见解显著推进了我们对鳞状细胞癌发生机制的理解，强调了CAV-上皮生态位在未来临床评估中的重要性。

Limitations of the study

研究的局限性

Para_06

1. 本研究设计的基因面板主要是为了表征上皮细胞的进化及其与基质细胞的相互作用。
2. 未来的研究应该扩大所考察的基因范围，以全面探索其他细胞群和亚群的进化和相互作用。
3. 此外，鉴于从同一受试者收集多阶段食管组织用于肿瘤发生研究的挑战和重要性，未来的研究应扩展多组学方法并增强时间分辨率。
4. 这一改进将有助于更详细地了解食管癌发生的时空过程。
5. 在我们的体外分析中，我们使用FAP和ACTA2（αSMA）作为肌成纤维细胞活化的标志物，这两种标志物在ESCC中的肌成纤维细胞中高度表达。
6. 然而，需要注意的是，iCAFs和周细胞也表达了不同水平的ACTA2，现有研究表明FAP和αSMA并不总是由CAFs共同表达。

Resource availability

Lead contact

主要联系人

Para_01

1. 进一步的信息和资源及试剂的需求应联系主要联系人陈武（[email protected]），并将由其满足。
2. ,

Materials availability

材料可用性

Para_01

1. 本研究没有产生新的独特试剂。

Data and code availability

数据和代码可用性

Para_01

1. 本研究没有生成任何算法或软件。可以在 GitHub (https://github.com/PansccSpat/SpatialMapESCC) 上获取用于重现主要图表的代码。如有必要重新分析本文报告的数据，请联系主要联系人。
2. 任何重新分析本文报告数据所需的附加信息均可根据请求从主要联系人处获得。

Acknowledgments