4大类中性粒-5种分离方法-6种死亡模式

1880年德国的医学家Paul Ehrlich因为这群多形核粒细胞不能被特定的酸碱染料染色，而将其命名为中性粒细胞。

*Paul Ehrlich和Élie Metchnikoff获得1908年诺贝尔生理或医学奖。

中性粒细胞分离方法

中性粒细胞占身体白细胞的50-70%（小鼠约为10-25%，注意这个差异对研究的影响），人体每天约产生1000亿个中性粒细胞，显然是不容忽视的免疫主力军。

中性粒细胞对外部信号高度敏感，很容易被血液采集方法、温度变化或分离过程本身激活，即使是极小百分比的污染也可能扭曲中性粒细胞表型，造成其细胞因子谱的显著变化，导致激活过程和亚群的结果相互矛盾。

目前使用的中性粒细胞表征方法通常依赖于密度梯度离心和通过沉降和/或裂解去除红细胞的组合。近期Frontier Immuno上的一篇文献对 最常见的五种中性粒细胞分离激活方法进行了测评：

Front. Immunol.

（1）Stemcell试剂盒： 后简称S。为免疫磁珠离心法。

（2）Miltenyi试剂盒： 后简称M； 也是基于负选免疫磁珠的离心法。

（3）Histopaque-1119/Percoll： 后称为H/P。属于密度梯度离心法。Histopaque-1119试剂盒用于第一次密度梯度离心，随后再使用Percoll分离液进行第二次密度梯度离心。

（4）Polymorphprep试剂盒： 后称为Pol。为密度梯度离心法。后续步骤需进行红细胞裂解。

（5）Dextran/Ficoll： 后称D/F。Dextran葡聚糖沉降，然后用聚蔗糖Ficoll分离液进行密度梯度离心和红细胞高渗裂解。

上述五种方法本身在处理步骤的数量、红细胞裂解要求、使用的化合物、价格和所需的总时间上就有所不同，也体现在中性粒细胞产量、纯度、活化和反应性的分析上。

结果：

其参考对照组为未处理的全血中性粒细胞。

方法	浓度 (cells/ ml input blood)	纯化率(%)	LPS响应(ROS)	TNF-α响应(溶解性死亡)	所需时间 min
S	1.71x10 6 ±0.067	97.22±1.77	**	**	35
M	1.72x10 6 ±0.076	97.91±1.06	**	**	45
H/P	1.15x10 6 ±0.079	94.1±3.61	*	*	70
Pol	0.88x10 6 ±0.094	78.96 ± 6.68	-	-	72
D/F	0.85x10 6 ±0.084	85.12 ± 6.78	-	-	77

• 与密度梯度分离的中性粒细胞相比，免疫磁性分离的中性粒细胞在ROS和裂解细胞死亡测定中表现出基线激活减少和对弱刺激的反应性增加。
• 两种免疫磁珠方法的始每毫升全血最高的平均中性粒细胞回收率；
• 通过评估淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的污染来评估每种方法分离的中性粒细胞部分的纯度，免疫磁珠方法和H/P法这三种相对较好。Pol法和D/F法获得的中性粒细胞组分中主要污染细胞类型为淋巴细胞和嗜酸性粒细胞；

4大类中性粒细胞的标志物

随着中性粒细胞发育成熟，c-kit、CXCR4、VLA4标志物逐渐消失，表达典型的成熟中性粒细胞膜标志物。但是在人体，中性粒细胞也是一群异质性非常强的细胞。

1. 骨髓成熟中性粒细胞

人：CD66b+ , CD15+ , CD33mid, CD49d– , CD101mid, CD10+ , CD16+ , CXCR4– , CXCR2+

小鼠：CD115– , CD11b+ , Siglec-F– , Gr1+ , CD101+ , Ly6Ghigh, CXCR4– , CXCR2+

2. 循环中性粒标志物

外周血中心粒细胞（Trends Immunol. 2019 ）

不成熟中性粒细胞

人：CD66b+ , CD11b+ , CD101mid, CD10– , CD16low, CD62Lhigh, CD117+ , CD49d+ , CD79b+ , CXCR4+ , CXCR2+

小鼠：Ly6Glow/mid, CD11b+ , CD101mid, CD62Lhigh, CD117+ , CXCR4+ , CXCR2low

成熟中性粒细胞

人：CD66b+ , CD11b+ , CD101+ , CD10+ , CD16+ , CD62Lhigh, CXCR4-CXCR2+

小鼠：Ly6Ghigh, CD11b+ , CD101+ , CD62Lhigh, CXCR4– , CXCR2+

老化中性粒细胞

人：CD66b+ , CD11b+ CD101+ , CD10+ , CD16+ , CD62Llow, CXCR4+ , CXCR2

小鼠：Ly6Ghigh, CD11b+ CD101+ , CD62Llow, CXCR4+ , CXCR2–

3. 肿瘤相关中性粒细胞

肿瘤血液及肿瘤组织局部中性粒细胞

（Trends Immunol. 2019 ）

不成熟中心粒细胞

人：CD66b+ , CD11b+ , CD117+ , CD10– , CD16int/low, LOX1+ , CD84+ , JAML+

小鼠：Ly6G+ , CD11b+ , CD117+ , CD170low, CD101– ,CD84+ JAML

成熟促肿瘤中性粒细胞

人：CD66b+ , CD11b+ , CD170high, PDL1+

小鼠：Ly6G+ , CD11b+ , PDL1+ , CD170high

成熟抗肿瘤中性粒细胞

人：CD66b+ , CD11b+ CD101+ , CD177+ (in CRC), CD170low, CD54+ , HLA-DR+ , CD86+ , CD15high

小鼠：Ly6G+ , CD11b+ , CD170low, CD177+ (in CRC), CD54+ , CD16+

*CRC：colorectal cancer 结肠直肠癌

4. 一些特殊群体

低密度中性粒细胞

健康人外周血主要是成熟的中心粒细胞，密度梯度离心时密度高，紧贴红细胞层，称之为正常密度中性粒细胞。

感染、炎症、自免以及肿瘤状态下，外周血中出现较多的不成熟的中性粒细胞，其密度低于成熟的中性粒细胞，与外周血的PBMC混在一层，称之为低密度中性粒细胞。

低密度的中性粒细胞也包括促炎症的成熟的中性粒细胞，为什么这群成熟的中性粒细胞密度也降低，尚不清楚。

CD177+中性粒细胞

45–65% 外周血中性粒细胞表达CD177 。

CD177(又称人中性粒细胞抗原NB1)是一种表达于质膜和中性粒细胞特定颗粒内的糖蛋白。已知，它通过与血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1或CD31)或β2整合素结合，促进中性粒细胞与内皮细胞的相互作用，以及它们向血管系统外的迁移。

由于CD177也作为膜结合蛋白酶3的受体，膜结合蛋白酶3是抗中性粒细胞细胞质抗体(ANCAs)靶向的主要抗原，CD177的表达与发生(ANCA)相关系统性血管炎易感性之间的关系正在研究中。

OLFM4+中性粒细胞

健康人体循环约20-25%的成熟中性粒细胞表达 OLFM4（olfactomedin 4），一种 糖蛋白，称为嗅素蛋白4，它包含在特定的中性粒细胞颗粒中，具体功能尚不清楚，因为OLFM4+和OLFM4−中性粒细胞没有表现出主要的功能差异。在脓毒症中，OLFM4+中性粒细胞的频率增加。

PMN-MDSC

PMN-MDSC（polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells）起初是指不成熟的具有抑制性的粒细胞，因而在功能和表型上，PMN-MDSC和肿瘤N2中性粒细胞有很多重叠，有时候二者很难区分。

小鼠模型中，促肿瘤中性粒使用的markers CD11b+- GR1+ Ly6G+，PMN-MDSC也是CD11b+ GR1+ Ly6G+。

人的样本： 成熟中性粒细胞被定义为CD15+CD66b+CD16+CD14−，PMN-MDSCs被定义为一个包含至少6个更复杂的表型标记，即CD15+CD66b+CD16+/−CD14− CD11b+/−CD33+HLA-DR− 来区分。但也有人将之称为调节性中性粒细胞。

APC样中性粒细胞

在感染及肿瘤样本中，循环中性粒细胞中，有一群具有抗原递呈能力的中性粒细胞，高表达MHC class II/HLA-DR+, CD80/ CD86。

6种死亡模式

1. 病原体诱导的细胞死亡（Pathogen-induced cell death (PICD）

PCID是中性粒细胞凋亡的重要方式，维持颗粒生成，耦合微生物杀伤，加入中性粒细胞清除，名曰：胞葬（Efferocytosis）（3）。

无法通过PCID清除的中性粒细胞，会发生坏死，随后释放颗粒，及DAMPs相关分子，引起局部炎症和组织损伤。已经有文献报道，胞葬功能缺失，中性粒细胞释放ROS，增加脂质氧化，加重炎症，引起动脉粥样硬化（4）。

2. 坏死（Necroptosis ）

坏死是一种程序性细胞死亡，Caspase在这种情况下没有被激活。坏死是由利用受感染细胞进行复制和免疫逃避的病原体（ 如细胞内病毒和寄生虫 ）触发的。

人类外周血的中性粒细胞，其坏死可通过激活死亡受体、TLRs，细胞内DNA和RNA传感器，以及受体激动剂IFN-α，粘附分子(包括CD44，CD11b，CD18和CD15)，或GM-CSF触发。

中性粒细胞坏死在人类疾病中的意义不是很明确，因为RIPK1和RIPK3通路和其他的死亡模式，如凋亡，焦亡具有交叉。

3. 焦亡（Pyroptosis）

焦亡是由胞内病原体（ 如志贺氏菌、图拉伦西斯氏菌、肠沙门氏菌和耶尔森氏菌，或细胞内暴露于LPS )，诱导产生炎性小体，而激活。

焦亡由炎性Caspase或中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(NSP)剪切，产生GSDMD的功能形式：

（1）GSDMD-N结合膜脂（磷脂酰肌醇磷酸盐和磷脂酰丝氨酸）使膜孔隙形成。 N端片段也可以直接通过结合病原体的内外膜中结合心磷脂，来杀死细胞内捕获的细菌，使他们的细胞膜穿孔。

（2）C末端片段则有自动抑制N端焦亡诱导活性

与坏死类似，焦亡消除了细胞内病原体所使用的生态位，并促进细胞外有毒中性粒细胞物质的释放失调。尤其是释放促炎细胞因子IL-1β，会升级促炎症反应，引起局部组织损伤。