实验科普｜蛋白质凝胶常见的染色方法

实验老司机 · 公众号 · · 2025-03-13 07:00

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在蛋白质组学及分子生物学研究中，凝胶电泳技术（如SDS-PAGE电泳）因其高分辨率分离能力，已成为解析复杂蛋白质混合物、评估分子量分布及翻译后修饰的核心技术。

凝胶电泳后的染色步骤是实验中至关重要的一环，通过与蛋白质的特异性结合，使电泳分离后的蛋白质条带得以显现出来，为后续的定性、定量分析以及质谱鉴定奠定基础。染色方法有很多种，下面为你介绍实验室常用的几种染色方法。

图片来源：https://www.khanacademy.org/test-prep/mcat/biomolecules/x04f6bc56:protein-analysis-techniques/a/protein-electrophoresis-and-sds-page

一、考马斯亮蓝染色（Coomassie Brilliant Blue, CBB）

考马斯亮蓝染色是一种经典的蛋白质染色方法，适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）后的蛋白质检测。考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）是一种酸性三苯甲烷染料，通过静电作用与蛋白质的碱性基团（如氨基、胍基）结合，同时通过疏水作用与蛋白质的疏水区域相互作用，形成蓝色复合物。

这种复合物在可见光下呈现深蓝色条带，从而实现蛋白质的可视化检测。这种方法灵敏度较高，可以检测到约0.1μg的蛋白质，且背景染色低，易于操作。

图片来源：https://doi.org/10.1371/journal.pone.0056168.g001

目前广泛用的考马斯亮蓝有G-250和R-250两种，G-250含三个磺酸基团和两个甲基，在酸性溶液中呈蓝偏绿色，与蛋白质通过疏水作用结合，形成深蓝色复合物，但脱色困难； R-250比G-250少两个甲基且磺酸基团较少，呈蓝色带红色调，通过静电和疏水双重作用缓慢结合，染色后可通过有机溶剂洗脱，操作成本低但耗时较长。 G-250质谱兼容性更优，而R-250适合常规染色及长期保存。

二、银染（Silver Staining）

银染法是一种基于金属银沉积显色的蛋白质检测技术，灵敏度可达0.1-1 ng/条带，比考马斯亮蓝染色高100-1000倍。

银染法的显色过程分为两个关键阶段：

1、银离子结合：

银离子（Ag⁺）通过静电作用与蛋白质的羧基（-COOH）、氨基（-NH₂）及硫醇基（-SH）结合，形成"蛋白质-银"复合物。

2、银离子还原：

在还原剂（如甲醛、硼氢化钠或硫代硫酸钠）的作用下，银离子（Ag⁺）被还原为金属银（Ag⁰），金属银在蛋白质表面沉积，形成可见的黑色或棕色条带，显色强度与蛋白含量正相关。

虽然银染法的灵敏度远高于考马斯亮蓝染色，但其操作步骤较为复杂，且甲醛的使用让凝胶中蛋白化学交联，导致质谱不兼容；线性范围窄，不太适合量化；核酸、脂类、糖脂类化合物常会对银染染色的结果进行干扰，导致实验重复率低。

图片来源：https://www.licorbio.com/applications/colorimetric-and-fluorescent-gel-staining

三、负染（Negative Staining）

负染法是一种通过选择性沉淀金属离子于凝胶背景，使蛋白质条带保持透明的快速检测技术。其核心是反向显影（背景染色，蛋白透明），负染液中的金属离子（如锌、铜、镍等）在凝胶的非蛋白区域（聚丙烯酰胺基质）形成不溶性盐沉淀，产生深色背景。蛋白质条带因表面电荷或化学特性阻碍金属盐沉积，保持透明或浅色，与深色背景形成对比。

常用方法包括 咪唑锌法 和 氯化铜法 ，以咪唑锌为例，锌离子通过配位作用与咪唑结合，形成复合物沉淀于凝胶基质；蛋白质条带因缺少结合位点保持透明。染色后可通过EDTA或磷酸缓冲液洗脱金属离子，恢复蛋白质活性。

图片来源：https://www.nacalai.com/global/Download/pdf/Gel_Negative_Stain_Kit.pdf

负染法的优点是快速、低成本、不破坏蛋白质活性；缺点是对比度较差，且重现性受到诸多物理化学因素的影响(例如染色液的pH，胶中阴离子的浓度、温度等)，因此限制本方法的广泛使用。

四、荧光染色（Fluorescent Staining）

荧光染色是一种基于荧光染料特异性标记蛋白质的高灵敏度检测技术，该方法灵敏度可达纳克级（如SYPRO Ruby灵敏度可达1-10 ng/条带）。其核心原理是通过荧光分子与蛋白质结合后，在特定波长光激发下发射荧光信号，从而实现可视化检测。

图片来源：https://www.researchgate.net/publication/323999097_Fluorogenic_Ag-Tetrazolate_Aggregation_Enables_Novel_and_Efficient_Fluorescent_Biological_Silver_Staining

常见的荧光染料如SYPRO Ruby和Deep Purple，它们与蛋白质的结合方式可能不同，有的是通过疏水相互作用，有的可能涉及静电作用或其他机制。

● 疏水作用主导型（如SYPRO Ruby、Deep Purple） ：染料通过疏水作用嵌入SDS包裹的蛋白质疏水区域，而非依赖静电结合。这种结合方式无需对蛋白质进行共价修饰，因此不会干扰蛋白质的结构和功能。

● 静电作用主导型（如Nile Red、Epicocconone） ：在非变性电泳中，染料通过静电作用结合蛋白质表面带电基团（如氨基、羧基）适用于Native-PAGE或特定修饰蛋白检测。

● 共价结合型（如FITC、Cy系列染料） ：通过化学反应（如与氨基共价结合）标记蛋白质，与疏水或静电作用型染料不同，共价结合型染料需要在电泳前，即蛋白质样品制备阶段，就与蛋白质发生反应。

以上就是蛋白质凝胶常见的几种染色方法，在实际应用中，我们需要根据实验目的、蛋白质丰度、后续分析需求以及实验条件等因素，综合考虑各种染色方法的优缺点，选择最合适的染色方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。

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