导读：基于十多年的技术积累和革新，体外转录（IVT） RNA技术的关注度因新冠mRNA疫苗的成功提升到了空前的高度。RNA在理论上可以生产出任何一种人类所需的蛋白质，用于传染病预防、肿瘤治疗、蛋白替代治疗、细胞治疗、再生医学等领域，mRNA的科研价值和商业价值无可比拟。与mRNA相比，环状RNA(circRNA)具有更高的稳定性，并且未修饰转录本的免疫原性也较低。circRNA的这两个关键优势，可以充分发挥RNA疗法的全部潜力。
2023年，中国食品药品检定研究院（简称中检院）研究团队在Frontiers in Immunology（IF:5.7）上发表综述《Research progress on circular RNA vaccines》，总结了circRNA的发现、体内代谢和生物学功能，以及circRNA疫苗的研究进展、生产过程、质量控制中的主要挑战及解决策略等，以期为circRNA疫苗相关研究提供参考。
COVID-19 mRNA疫苗是首个获批的mRNA疫苗，其可诱导高水平的体液免疫和细胞免疫反应，全球已接种超40亿剂mRNA疫苗，约占免疫接种总数的1/3。目前，约40种mRNA疫苗处于临床试验阶段，其中多种已批准上市或获得紧急使用授权。
COVID-19 mRNA疫苗为线性结构，稳定性差。circRNA因具有由共价键形成的单链闭环结构，在体内具有较高稳定性，且可进行蛋白质编码和翻译，为疫苗开发提供潜力。开发的COVID-19 circRNA疫苗，不仅具有线性mRNA疫苗的优势（快速和可编辑性等），且在一定温度范围内比线性mRNA疫苗具更高的稳定性和更长的蛋白表达时间，低剂量即可引发强烈的免疫反应。因此，一些研究人员认为circRNA疫苗可成为应对未来新型重大传染病或其他常见病毒性疾病（如HBV、HHV、EBV、IAV和HPV）的有力工具，并可能开发用于细胞疗法或治疗性肿瘤疫苗。
1971年，在马铃薯纺锤体块茎病研究中发现可入侵植物并致植物死亡的缺少蛋白外壳的病毒样分子，称为“类病毒”。1976年Sanger等人首次将类病毒描述为单链共价闭合的circRNA分子。1979年，Hsu和Coca-Prados使用电子显微镜发现HeLa细胞中存在无自由侧翼末端的circRNA分子，首次报道在真核细胞中观察到circRNA分子。1990年代初，鉴定并表征由内源性RNA产生的circRNA。
后续研究提出了产生这类分子的机制，如假设反向重复序列是Sry环化所必需的。2010年起，随着RNA测序和生物信息学技术的发展，揭示了不同生物体（如人类、小鼠、植物、隐球菌、斑马鱼和原生生物）中存在多种高度保守的circRNA，使circRNA研究爆炸式增长。2015年，首次报道能编码和翻译蛋白的circRNA。2017年开始，现代分子生物学实验技术的应用使先前研究发现的各种circRNA得以验证。2018年研究人员成功合成能表达蛋白质的circRNA，用于疫苗开发。2022年，开始研究COVID-19 circRNA疫苗和治疗性肿瘤或遗传疾病疫苗。
图1 circRNA研究的重大发现
RNA经反向剪接和外显子跳跃在体内循环。反向剪接的RNA环化是RNA出现断点后，下游5'剪接供体位点与上游3'剪接受体位点的反向连接，后内含子序列经选择性剪切产生circRNA。外显子跳跃实现的RNA环化是外显子与内含子剪接后发生环化的过程。不同的断点位置有助于circRNA的多样性，不同类型的circRNA由外显子、内含子、基因间区域或非转录区域通过反向剪接随机组合产生。
根据序列组合差异，circRNA分为4类：（1）外显子circRNA：仅含外显子，占总circRNA的80%以上，通过套索驱动的环化或直接反向剪接环化产生。两个侧翼内含子间的碱基配对使下游5'ss和上游3'ss结合，促进反向剪接反应以产生circRNA；（2）外显子-内含子circRNA：又称eiciRNA，由外显子跳跃环化产生，隐藏在核心外显子的侧翼内含子序列通常需剪接；（3）内含子circRNA：由从套索衍生机制的分枝中逃脱的内含子产生，依赖于前体mRNA 5'剪接位点附近共有鸟嘌呤（G）和尿嘧啶（U）富集结构域和断点附近富含胞嘧啶（C）结构域。富含GU的结构域可保护富含C结构域不发生分支或降解，产生稳定circRNA；（4）tRNA内含子circRNA：由前体tRNA被tRNA剪接核酸内切酶（TSEN）复合物切割裂解产生的外显子和内含子连接形成。
图2 4种类型circRNA
（1）基因转录调节：circRNA可与宿主DNA结合形成R-loop，影响DNA复制、转录和损伤后修复。如circSEP3通过与cSMARCA5形成R-loop导致转录终止；circRHOT1将Tat互作蛋白60kDa（TIP60）募集到NR2F6启动子上，诱导原癌基因表达促进肝细胞癌中的细胞增殖、迁移和侵袭。
（2）“海绵”效应：天然circRNA对microRNA（miRNA）或蛋白表现出“海绵”效应。如circHIPK3与miR-124结合并抑制其活性；circHIPK2通过靶向miR124-2HG调节星形胶质细胞活化；circNfix与Ybx1（过表达导致不良预后及各种肿瘤复发）和Nedd4l结合，促进其相互作用并诱导Ybx1降解。
（3）通过形成复合物激活蛋白：EBV感染宿主后产生circBART2.2，被细胞RIG-I受体识别，RIG-I受体被激活后通过下游干扰素信号通路实现抗病毒作用。但m6A甲基化修饰后的circRNA未被RIG-I受体识别。
（4）蛋白翻译：2015年在果蝇中首次发现circRNA编码和翻译蛋白的能力。circRNA由IRES或MIRES介导翻译起始：IRES将核糖体募集到mRNA内部区域以启动翻译，可通过募集不同反式作用因子促进核糖体组装和启动翻译，如circMbl和circFGFR1；MIRES介导的翻译起始涉及RNA中一或多个位点发生m6A甲基化，使eIF4G2的募集用于翻译起始。
circRNA的稳定闭环结构可使其免受核糖核酸外切酶（如RNaseR）裂解。研究发现dsRNA或poly（I：C）可在体内激活内切酶RNase L降解circRNA；ATP依赖性RNA解旋酶、UPF1和核酸内切酶G3BP1可识别具复杂二级结构的circRNA并诱导其降解；HRSP12可识别circRNA的m6A修饰，其与RNase P/MRP内切酶复合体相互作用诱导circRNA降解；circRNA可通过特异性引物和探针靶向被内切酶RNase H降解；miR-671与circRNA CDR1as序列的互补结合也诱导AGO2介导的circRNA降解。
人工制备circRNA的方法：（1）化学合成：BrCN或EDC诱导线性RNA的5'-端磷酸和3'端羟基间形成共价键，产生circRNA，但该过程易产生2'-5'磷酸二酯键；（2）T4 RNA连接酶连接：线性RNA分子5'-端单磷酸基团与3'-端羟基经T4 RNA连接酶作用形成共价键而环化，因此使用T7 RNA聚合酶体外合成的RNA在环化前须去除两个磷酸基团，其中RppH用于去除β和γ磷酸；（3）内含子自剪接：I/II类内含子可执行RNase功能，使线性RNA分子形成circRNA。
图3 体内外（人工）circRNA的环化方法
2015年，通过构建含分裂GFP的单外显子小基因，发现前体mRNA可在人和果蝇细胞中高效反向剪接产生可翻译circRNA。2018年，使用IRES介导翻译起始的I类内含子剪接法合成编码EGFP的circRNA，在293T细胞持续表达168h，而线性mRNA仅表达48h。目前人工合成表达蛋白的circRNA主要通过内含子剪接（图4A）或T4 RNA连接酶连接（图4B）产生。
图4 制备circRNA疫苗的方法
Wei等人采用IRES介导翻译起始的I类内含子剪接法开发一种针对原始COVID-19毒株的LNP-circRNA疫苗。分别以10μg、50μg/只剂量免疫小鼠，均引起较强的Th1免疫反应。猴子接受两剂100μg/只的疫苗后进行原始病毒株攻击实验，免疫组肺部病毒载量、肺损伤程度和肺部浸润性炎症细胞数量显著降低。随后针对COVID-19 Delta变体、Omicron BA1变体的circRNA疫苗实验证明疫苗的广谱活性及高稳定性。
Wang等人使用II类内含子剪接法制备COVID-19 circRNA疫苗用于小鼠免疫，引发强烈的RBD特异性记忆B细胞反应和平衡的Th1/Th2细胞免疫反应，血清IgG滴度为线性mRNA疫苗的10倍。
使用T4 dt内含子剪接法进行RNA环化会产生“剪接疤痕”序列，不同的序列长度导致不同的拓扑结构。circRNA组成元件及组成差异（载体拓扑结构、非翻译区（UTR）和IRES等）影响翻译效率。通过不同剪接疤痕、5'UTR、3'UTR和IRES序列的实验对比，发现使用50nt长剪接疤痕序列和Apt-eIF4G序列作为5'UTR、全长HBA1序列作为3'UTR及野生型iCVB3序列作为IRES构建的circRNA翻译效率显著提高，在293T细胞中持续表达7天，而线性mRNA疫苗仅表达3天。综上，当以低剂量给药时，circRNA疫苗不仅具有强免疫原性，且持续表达蛋白时间更长。
circRNA和线性mRNA疫苗间的差异：（1）体内降解方法不同；（2）circRNA疫苗主要使用IRES介导的翻译途径，线性mRNA疫苗使用5'帽（m7GpppN）结构介导的翻译途径，二者通过涉及不同起始因子的转录起始复合体翻译成蛋白；（3）circRNA疫苗因环形结构不易被降解而无需修饰，线性mRNA疫苗需假尿苷、5'帽和3'poly（A）等修饰。
目前circRNA疫苗工业化生产步骤如下：
（1）质粒作模板，经体外转录合成线性RNA分子；
（2）RNA环化，其中内含子剪接法因无需添加酶而具较好应用前景，T4 RNA连接酶连接也可用于circRNA工业化生产，但对序列长度>2000nt的RNA分子环化效率较低；
（3）使用递送系统（如LNP）进行疫苗包封。环化反应会产生如线性RNA前体、剪接的RNA序列等杂质，常采用色谱法去除。由于提高RNA环化效率导致杂质含量降低，因此提高环化效率可能是简化纯化过程的可行方法。有研究表明，在pH=7.5且终浓度为50mM Tris-HCl、10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲溶液中进行环化，有效提高RNA环化效率。
图5 circRNA疫苗生产工艺流程图
WHO发布关于评估mRNA疫苗预防传染病的质量、安全性和有效性的监管考虑指导文件。USP制定了mRNA疫苗质量分析程序，NMPA药物评价中心（CDE）发布了预防性COVID-19 mRNA疫苗药物研究技术的指导原则（试行），上述指导文件可作为制定circRNA疫苗质量控制过程的参考。
环化率、纯度是circRNA疫苗的关键质量属性(CQA)，常利用毛细管电泳（CE）和HPLC测定。T4 RNA连接酶、RNase R及dsRNA的残留量使用ELISA进行质量控制，其中测定疫苗中dsRNA残留量常使用抗dsRNA J2抗体，但circRNA是否可直接结合抗dsRNA J2抗体或干扰抗dsRNA J2抗体与dsRNA结合的研究尚未报道，故使用该法前需进行样品适用性分析。
由于研发、生产、质量控制和安全等方面的问题，circRNA的研究仍处于临床前阶段，后续通过优化条件或开发新型方法解决上述问题对于使circRNA疫苗成为应对未来新型重大传染病、常见病毒性疾病工具或治疗性肿瘤疫苗至关重要。
