转录+代谢解析意大利蜜蜂和中国蜜蜂抵御草甘膦胁迫的分子机制
期刊：
Science of the Total Environment
发表时间：
2020.07
IF:
6.551
单位：
山东农业大学胥保华、郭兴启教授团队
2020年7月，山东农业大学胥保华、郭兴启教授团队在
Science of the Total Environment
发表了名为“
Transcriptomic and metabolomic landscape of the molecular effects of glyphosate commercial formulation on Apis mellifera ligustica and Apis cerana cerana.
”的论文。本研究基于广泛靶向代谢组和转录组技术研究平台，对草甘膦胁迫下的中华蜜蜂和意大利蜜蜂的分子反应机制进行了探讨，
发现相较于意大利蜜蜂，中华蜜蜂能以更小的适应成本来抵御草甘膦胁迫
。
迈维代谢提供了广泛靶向代谢组检测分析的服务
。
昆虫授粉对作物生产、野生植物和全球生物多样性至关重要，蜜蜂是世界上最经济且突出的昆虫传粉者之一。然而近年来，因为不同农业化学药物的滥用，导致了蜜蜂数量的下降和蜂群的损失。之前人们主要关注农药对蜜蜂的影响，而对蜜蜂数量下降和除草剂的关系关注较少。已有研究报道草甘膦的暴露对蜜蜂的生理和发育、对成蜂的行为和生理状态有负面影响，但在基因层面和代谢物水平上，草甘膦及其商业配方对成年蜜蜂的作用方式仍不清楚。
本研究将以组学手段来了解草甘膦商业配方(GCF)对中华蜜蜂和意大利蜜蜂采食成虫作用的详细模式，并确定哪些基因和代谢途径受到GCF的影响。此外，还研究了这两种蜜蜂对GCF反应的异同
。
草甘膦处理溶液的配置：
使用30% (W/V)无菌蔗糖溶液将GCF（含30% w/v草甘膦和41% N-膦酰甲基）稀释150倍。
样本：
本研究中使用的意大利蜜蜂和中华蜜蜂保存于山东农业大学一个没有使用杀虫剂或者没有农业活动的地方。从6个健康的户外蜂群中采集样本，相当于6个生物学重复，每个群落取成虫50只，随机分为两组，各组饲养于12*12*5cm的木笼中，处理组每天饲喂5ml含GCF的蔗糖溶液，对照组饲喂不含GCF的蔗糖溶液。
技术路线：
1、转录组分析
—差异基因统计和GO、KEGG注释—探究GCF处理下DEGs的功能
实验发现GCF处理3天和5天对中华蜜蜂和意大利蜜蜂的存活率没有显著影响。
为了确定GCF对蜜蜂内在分子机制的影响，对暴露于GCF3天和5天的蜜蜂进行了转录组测序
。鉴定到的基因个数以及基于FC＞1.5和p＜0.05筛选到的差异基因情况统计如图1A所示。
为了探究GCF处理3天和5天的蜜蜂的基因表达差异，对两个比较组的DEGs进行了比较分析
，结果统计见图1B。值得注意的是受GCF胁迫后，抗菌肽、表皮蛋白、细胞色素P450基因家族的基因表达上调，热休克蛋白、OBP蛋白基因家族的基因表达下调。
为了探究GCF处理下蜜蜂中DEGs的功能，对DEGs进行了GO分析
，发现两种蜂暴露于GCF 5天后，与代谢过程、生长发育过程、对刺激的反应、繁殖和免疫系统相关的下调基因比例显著高于暴露于GCF 3天后。
表明GCF会损害蜜蜂的生长发育、繁殖和免疫系统过程等关键途径，并且随着GCF暴露时间的增加，这种有害影响会不断累积
。为了进一步确定DEGs的功能，筛选了前10个DEGs显著富集的条目。这些结果进一步表明，GCF对蜜蜂的许多信号通路产生影响。
为了进一步探究暴露于GCF后的蜜蜂中DEGs的功能，进行了KEGG富集分析
。在AccGCF3d/AccUnt3d和AccGCF5d/AccUnt5d中发现许多DEGs与碳水化合物代谢、能量代谢、免疫系统和脂质代谢有关；AmGCF3d/AmUnt3d和AmGCF5d/AmUnt5d中的DEGs与氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢等许多重要途径相关。
这些结果进一步表明，GCF影响了蜜蜂体内许多重要的代谢途径
。
图1. 中华蜜蜂和意大利蜜蜂暴露于GCF后的转录组分析。A：不同样本基因数量统计和差异基因数量统计；B：不同比较组的韦恩图统计；C：差异基因在不同通路上的上下调比例统计
2、比较转录组分析
—韦恩图、GO注释分析—比较两种蜜蜂应对GCF的基因响应
为了比较中华蜜蜂和意大利蜜蜂对GCF的响应，对它们的RNAseq数据进行了比较分析
。暴露于GCF3天和5天后，中华蜜蜂的DEGs数量比意大利蜜蜂多，尤其是抗菌肽、表皮蛋白、OBP、气味受体、CYP450和热激蛋白家族的DEGs数量。
这个结果表明中华蜜蜂比意大利蜜蜂更敏感。
随后进行了Venn分析，以确定暴露于GCF后的中华蜜蜂和意大利蜜蜂中协同调控的DEGs
。发现在
AccGCF3d/AccUnt3d
和
AmGCF3d/AmUnt3d
两个比较组中共有的差异基因有13个，都上调（
co-upregulated
）8个，均下调（
co-downregulated
）的2个，另外3个基因表达模式相反(图2A-B)。此外， 52个基因在
AccGCF5d / AccUnt5d
和
AmGCF5d / AmUnt5d
比较组中均发生变化,其中,20个
co-upregulated
, 27个
co-downregulated
和5个调控模式相反的基因(图2 a - b)。
AccGCF5d / AccUnt5d
和
AmGCF5d / AmUnt5d
中共有的基因呈现较强的正相关(R = 0.7712)，比
AccGCF3d / AccUnt3d
和
AmGCF3d / AmUnt3d
(R = 0.3839)相关性强(图2)。
这些结果表明中华蜜蜂和意大利蜜蜂利用许多相同的基因对抗GCF，且这一现象在暴露于GCF 5天后比3天更为明显。
GO分析显示，暴露于GCF胁迫下的中华蜜蜂和意大利蜜蜂重叠的DEGs在许多关键通路中富集，如发育过程、免疫系统过程和对刺激的反应(图2D)。这些途径可能在两种蜜蜂对GCF的响应中都起到了一定的作用
。此外，为了验证RNA-seq结果，我们进行了RT-qPCR检测，发现在GCF胁迫下中华蜜蜂和意大利蜜蜂中有很多基因被协同调控(图2E)，这与RNA-seq结果一致(图2B)。
图2. GCF处理后的比较转录组分析。A：比较组的韦恩图结果展示；B：差异基因表达量热图展示；C：差异基因变化相关性分析；D：差异基因GO注释；E：RT-qPCR验证结果
3、代谢组分析
—差异物质筛选、KEGG注释及富集—探究GCF对蜜蜂的分子效应
为了进一步研究GCF对蜜蜂的分子效应，进行了广泛靶向代谢组学分析
。PCA和OPLS-DA分析显示出GCF处理的蜜蜂和相应的对照蜜蜂之间的良好分离。在AccGCF5d / AccUnt5d比较组中共鉴定到595种代谢物,基于VIP ＞ 1, P ＜0.05和FC＞1.5筛选出120种差异代谢物 (68个上调和52个下调)。在AmGCF5d / AmUnt5d比较组中共鉴定到596种代谢物,基于VIP ＞ 1, P ＜0.05和FC＞1.5筛选出72种差异代谢物 (37个上调和35个显示下调)。
对差异物质进行KEGG注释分析，以探索暴露于GCF胁迫下的蜜蜂代谢产物的功能
。AccGCF5d/AccUnt5d和AmGCF5d/AmUnt5d比较组的差异代谢物在氨基酸代谢、碳水化合物代谢、消化系统、能量代谢、免疫系统、脂质代谢、神经系统、感觉系统和膜转运等多种途径上富集(图3)，
说明GCF干扰了蜜蜂的正常代谢
。
为了研究中华蜜蜂和意大利蜜蜂在代谢水平上对GCF反应的异同，对它们的差异代谢物进行了比较分析
。结果显示，在AccGCF5d/AccUnt5d和AmGCF5d/AmUnt5d比较组中均存在的代谢物有33个，包括15个co-upregulated的代谢物，17个co-downregulated的代谢物和1个调控模式相反的物质(图4A)。相关分析显示，AccGCF5d/AccUnt5d与AmGCF5d/ AmUnt5d的协同调控代谢物呈显著正相关(R = 0.918)(图4B)。这些协同调控的代谢物在许多关键途径中富集，如氨基酸和碳水化合物代谢组学(图4C)。
这些结果表明，尽管存在一定的差异，但在GCF胁迫下，中华蜜蜂和意大利蜜蜂均会采取一定的防御策略。
图3. 暴露于GCF后改变了蜜蜂体内重要代谢途径中的代谢物丰度。A：AccGCF5d / AccUnt5d和AmGCF5d / AmUnt5d比较组中差异物质的类别统计；B：不同类别中物质的上下调情况；C：差异物质富集气泡图
图4. GCF胁迫下中华蜜蜂和意大利蜜蜂的差异物质的重叠性分析。A：韦恩图展示；B：AccGCF5d/AccUnt5d与AmGCF5d/AmUnt5d比较组中差异表达代谢物相关性分析；C：重叠代谢物丰度对数倍变化的层次聚类分析
4、转录组和代谢组联合分析
—相关性网络图—解析蜜蜂响应GCF的调控网络
为了进一步了解蜜蜂对GCF胁迫反应的调控网络，对转录组和代谢组进行了多组学相关分析。
发现在中华蜜蜂和意大利蜜蜂中，许多基因和代谢物表现出强烈的正相关(R ＞0.8)(图5A)。
结果表明,这些DEGs可能直接或间接影响相应的代谢物变化
。
此外还发现在中华蜜蜂和意大利蜜蜂许多DEGs和差异表达代谢物被富集在同一个KEGG通路,这些通路包括酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和刺激神经组织中的相互作用(图5 B)。本研究还利用相关性网络图进一步显示中华蜜蜂和意大利蜜蜂的DEGs与差异代谢物之间的关联(图5C)。
这些结果进一步表明，GCF影响了蜜蜂的转录组和代谢组调控网络
。
图5. GCF胁迫下中华蜜蜂和意大利蜜蜂的转录组和代谢组数据的相关性分析。A：九象限图；B：差异基因和差异物质的KEGG共注释；C：差异基因和物质的相关性网络图
研究目的：
通过转录组和代谢组解析中华蜜蜂和意大利蜜蜂抵御草甘膦胁迫的分子机制。
研究结果：
研究数据清楚地表明GCF干扰了蜜蜂的转录和代谢调节网络。GCF对蜜蜂的不利影响随着GCF暴露时间的增加而增强。然而，蜜蜂努力协调关键的防御途径，如代谢过程、解毒、免疫系统和能量代谢，以促进其在GCF胁迫下的生存。中华蜜蜂可能对GCF的毒性有较好的耐受性。因此能够以较低的适应度成本耐受较高剂量的GCF。
迈维小结：
本研究利用多组学比较解析了中华蜜蜂和意大利蜜蜂对于GCF胁迫的反应，从基因到代谢物系统全面的说明了内在机制的差异，后期也可以考虑从蛋白组层面进行分析。
