透射电镜样品制备技术指南：材料科学篇

使用透射电镜（ TEM ）的第一步是样品制备，这步骤是确保获得有价值 TEM 结果的重中之重。制备的 TEM 样品一般需满足以下几个基本要求：

若样品无法完全符合上述要求，则需在 TEM 操作中应用特殊技术。例如，对于极度电子束敏感的样品，如生物软物质，可以采用低剂量成像技术以保护样品。

样品制备方法需基于样品种类、性质以及所需信息进行选择。目前已开发出多种样品制备技术，覆盖了材料样品和生物样品两大领域。材料样品一般指物理科学研究的固体，如金属、陶瓷、复合材料及聚合物；而生物样品则包括细胞、组织和生物颗粒。虽然这两种样品的制备方法有所区分，但偶尔也会交叉适用，例如生物样品的一些制备技术可用于材料样品。

1 材料样品

材料样品通常以固态和脱水形式存在，例如 颗粒、粉末、薄膜或致密固体 。常见的制备方法包括： TEM 样品 载网 法、离子减薄、电 解 抛光、聚焦离子束（ FIB ）以及超薄切片法。表 1 比较了这些主要方法及其在不同材料上的应用。不论采用何种方法，制备过程应基于实际需求作适当调整。

表 1 材料类样品制备方法汇总

2 TEM 样品 载网 法

对于颗粒或粉末样品，使用 TEM 样品 载网 作为支撑是常见做法。通常 载网 直径为 3.05 毫米，个别场景下也选用 2.3 毫米直径。 载网 厚度多在 5-30 微米范围内，其网眼大小用 目数 定义。例如， 100 目 载网 表示每英寸（ 25.4 毫米）含 100 条线。

表 2.2 列出了各种网眼尺寸对应的线间距。然而，由于 载网 线存在宽度，实际开放空间往往略小于理论值。一般来说， 200 目和 400 目 载网 适用于大多数场景， 150 目 载网 多用于大开口需求，而 1000 目 载网 适合极小开口需求。 载网 还可制成方形、矩形、六边形及单孔等多种图案。

表 2 TEM 样品 载网 尺寸

载网 材料可以是铜、镍、金、钼、钛、铍或不锈钢。这些材料各有特点，铜因其低成本及非磁性而常被选用。但在分析样品含铜成分时，为避免 载网 信号干扰，建议更换为其他材料。此外，在原位加热实验若温度接近或超过铜的熔点（ 1,085°C ），亦不宜使用铜 载网 。

一些 载网 上覆盖了特定的支撑膜，包括 碳膜、聚甲醛、氧化硅、氮化硅 或其组合。这些膜具有不同厚度，且可能连续覆盖或带孔洞以减少背景信号。纯碳膜因其机械强度高、化学稳定性好及良好导电性，而被广泛采用。但为满足某些特殊需求，如增强样品吸附性，有时也会选用其他膜类型。如果膜不具有导电性，建议在其 表面再涂覆一层碳膜 ，以确保样品在电子束下稳定运行。

需要注意的是，支撑膜一般只涂覆在 载网 的一面，通常较深色的一侧为膜面（参见图 1a 中箭头标注的数字 “1” ）。通过低倍率立体显微镜可轻松辨别支撑膜的存在和厚度。

图 1 TEM 样品载网制备。 (a) 顶部涂有支撑膜的 TEM 样品载网； (b) 用于转移溶液的滴管； (c) 将溶液滴到放置在滤纸上的载网上； (d) 用镊子夹住向上的载网，在其表面沉积一小滴溶液。用一小片滤纸吸去多余的溶液； (e) 经过 辉光放电处理的载网具有亲水表面 ，使溶液滴能在表面铺展； (f) 未经辉光放电处理的载网具有疏水表面，溶液滴不会在表面铺展； (g) 纯碳支撑膜上分散良好的氧化铝颗粒的 TEM 图像； (h) 沉积在多孔网状支撑膜上的碳纤维粉末碎片。在楔形颗粒的边缘，其薄度足以进行电子衍射或高分辨成像。

参照图 1 ， TEM 载网 制备包括以下 详细 步骤：

1 溶液制备 ： 当样品为粉末形式时，可使用玛瑙研钵和研杵将颗粒进一步研磨至更精细，然后用不与样品发生反应的溶剂制备溶液，通常选择纯乙醇。溶剂的蒸发可以使粉末颗粒更稳固地吸附在支撑膜上，避免直接撒粉时小颗粒从载网上脱落进而污染设备。碳膜涂层在此过程中能有效帮助颗粒附着，降低污染风险。

2. TEM 载网的辉光放电处理 ： 将载网置于辉光放电装置中进行短时处理，确保支撑膜面朝向离子源。辉光放电通过高压电场产生等离子流，能够清洁膜表面并将其表面性质从疏水性改为亲水性。从而提升溶液在膜表面的铺展效果，注意 避免过长处理时间以免损伤支撑膜 。部分设备支持全自动辉光放电操作。

样品经过 COOLGLOW 辉光放电仪亲水化后，样品均匀稳定分布，不存在样品与染色剂凝集的问题，染色效果更好。 来源：速普官网

3 . 将溶液转移至载网上

静置沉降 ：使用塑料滴管或微量移液器取 5-10 微升样品溶液，静置 60 秒以上以让较大颗粒沉降。轻轻挤压滴管丢弃底部大颗粒部分，保留剩余溶液用于滴加操作。 滴加技巧 ：采用以下方法将溶液沉积于载网：

方法一：将载网放置于滤纸上，膜面朝上，直接滴加溶液（见图 1c ）。

方法二：用镊子固定载网（可辅助橡皮圈），保证膜朝上，滴上 3-5 微升溶液（见图 d ）。必要时可用小片滤纸轻轻吸除多余溶液。

液滴铺展与干燥 ：通过辉光放电处理的载网，其表面液滴分布较为均匀（见图 1 e ）；若未进行辉光放电，可能会观察到液滴较大接触角及不规则铺展状态（见图 1f ）。若缺乏辉光装置， 清洗膜面多次也可能改善亲水性 。最终，将溶液自然干燥，获得可直接用于 TEM 实验的载网样品。

需要注意的是，空气干燥可能导致样品发生不良变化，例如纳米颗粒聚集或水合物的改变。为减小此影响，推荐使用冷冻干燥技术。

冷冻干燥步骤 ：将步骤 3 完成后的载网迅速浸入液氮冷却至完全冻结；转移至真空冷冻干燥设备中，在真空和低温条件下脱水，直至冰完全升华消失；处理完成后，将干燥后载网样品用于 TEM 实验。

对于没有冷冻干燥设备的实验室，可通过简单工具实现冷冻干燥：准备一块性能优良的金属冷源（如高比热铝块），将其预冷至液氮温度后放入真空室；把冷冻样品置于冷却金属顶部面，再启动真空系统完成升华操作。

另一种干燥溶液的方法是临界点干燥，使用六甲基二硅胺（ HMDS ）化学处理的临界点干燥适用于特定类型样品，其操作流程如下：

这种临界点干燥方法操作简单，但制备的样品会涉及 HMDS 化学品。

部分实验可能要求样品沉积于无任何支撑膜的裸载网上，以消除背景信号影响。在这种情况下：载网选择：推荐使用高目数 载网 （ ≥1000 目）以提供更高分辨率（见图 2a ）。操作建议：用镊子夹住裸载网直立干燥表面溶液颗粒（见图 2b ），避免直接接触滤纸吸收。最终可能获得颗粒集中附着于 载网 线的样品（如图 2c ）。

图 2 无支撑膜的 TEM 样品 载网 制备。 (a) 空白 载网 ； (b) 滴加液滴直至干燥； (c) 颗粒附着在 载网 栅条上以供 TEM 观察。

用户可能会为特殊需求发明新的制备方法 . 图 3 展示了两个例子。为了实现纳米颗粒在 TEM 载网 上的自组装，如图 3(a) 所示，用自闭合镊子夹住一片带有支撑膜的 200 目 TEM 载网 ，将其浸入装有 Pt3Ni 纳米八面体的己烷悬浮液的小瓶中。

让溶剂在环境条件下蒸发，直到胶体溶液的液面降到 TEM 载网 以下，使 载网 露出溶液。在蒸发过程中，纳米颗粒在 TEM 载网 的顶面很好地组装，如图 3(c) 的 STEM 图像所示，形成了三层组装。

图 3 特殊 TEM 样品 载网 制备。 (a) 将 载网 浸入溶液中，直至容器中的溶液逐渐干燥； (b) 将 载网 放置在硅片表面，并滴加溶液。该装置用称量皿覆盖并用密封胶带封边以控制蒸发过程； (c) 采用方法 (a) 制备的三层组装的 Pt3Ni 纳米颗粒的 STEM 图像；以及 (d) 采用方法 (b) 制备的 Pt 纳米立方体的 TEM 图像。

图 3(b) 展示了另一个 TEM 样品 载网 制备的例子。将一片 200 目带支撑膜的 载网 放置在表面经 (111) 面抛光的 15 mm × 15 mm 方形硅片上，然后将铂纳米立方体溶液滴加到 载网 上。由于胶体悬浮液在硅片上具有相当大的表面张力，底部硅片被特意设计用来 限制铂纳米颗粒悬浮液不会扩散 ，同时在铜 载网 上收集组装体。

在典型的样品制备中，将 20 μL 的原始分散液滴加到基底上，立即用称量皿（长 41 mm ，高 8 mm ）盖住，并用密封胶带密封。图 3(d) 显示了自组装铂纳米立方体的 TEM 图像，其中单层纳米立方体在大面积范围内实现了良好的组装。

3 离子减薄

如果样品是块状硬质材料，为了保持其微观结构的完整性，其制备过程与粉末样品不同。一种常用方法是离子减薄，这是一种适用于所有固体样品的通用技术，无论是导电还是非导电样品。其具体流程如图 4 所示，并包括以下步骤：

图 4 离子减薄工艺流程。 (a) 切割； (b) 将薄片放置于样品台上进行研磨和抛光； (c) 钻取小圆片； (d) 凹坑加工； (e) 离子减薄。

1. 切割。 使用精密切割机和磨料轮将块状样品切成薄片（图 4a ）。切片厚度可由切割机控制。如果太薄，切片可能会断裂或变形；如果太厚，会消耗更多材料，后续程序中需要更多努力来使其变薄。通常 0.7mm 是最佳厚度。应使用切割液以防止样品发热并润滑切割工具，每隔几分钟应使用修整工具清除锯片表面的碎屑。这个切割过程通常需要几分钟，操作者应在现场直到完成。

2. 研磨和抛光 。为了便于操作，将薄片用晶体粘结蜡粘到样品架上（图 4b ），如大型铝柱。该蜡在加热至 120-150°C 时熔化，冷却后可粘结样品，可用丙酮溶解。研磨时应注意避免样品被磨掉或从粘结处剥离。从粗砂纸逐渐过渡到细砂纸进行研磨，然后进行抛光。两面都需要抛光，不用于凹坑加工的背面应充分抛光。抛光后，样品厚度应小于 100 μm ，通常可达到 60 μm 。

3. 使用 超声波切片机 将样品钻成直径约 3 mm 或稍小的小圆片（图 4c ）。如果样品是延性材料，如金属，则使用打孔器获得薄圆片。

4. 凹坑加工 。用晶体粘结蜡将圆片安装在凹坑加工机支架上，在其顶面加工凹坑（图 4d ）。为获得良好的 TEM 样品，这个过程非常关键，因为这是一个在最终样品上不产生缺陷的机械去除材料的过程。此阶段 剩余厚度应尽可能薄但不能穿透 。如果太厚，将需要较长的离子减薄时间，这可能会增加离子减薄缺陷。如果可能的话，稍微进一步凹坑加工以减薄厚度，将显著减少后续离子减薄时间，但应注意避免样品出现孔洞或破裂。通常在凹坑加工过程后，剩余样品厚度应达到 10-20 μm 。此外，凹坑加工可用于粗略选择穿孔位置。

5. 离子减薄 。如果样品是脆性的，可用环氧树脂将其固定在金属垫圈（或环）上。离子减薄可以在双面或单面进行。 冷却 可减少离子束对样品的损伤。 当出现小孔时，应立即停止减薄 。

图 5 (a) 凹 坑加工 过程； (b) 加工的 几何形状。

如果样品是 硅 ，用强光照射样品背面。如果凹坑区域 呈现透明的红色，剩余厚度约为 10μm ；如果呈现橙色，厚度更薄，约为 5μm 。凹坑加工过程至少应出现红色。

另外，可以使用光学显微镜检查凹坑样品的厚度。首先聚焦在样品顶面，然后聚焦在凹坑底部。从顶部到底部（或反向）的焦距差，可以从显微镜上读取，即为去除材料的厚度 t 。

离子减薄设备使用入射氩离子束从表面去除或溅射样品原子（图 6a ），使中心区域在减薄过程中逐渐变薄。

溅射是入射离子与表面样品原子之间动量传递的结果。有几个因素控制离子减薄过程：

图 6 离子减薄过程 (a) ，以及通过离子减薄制备的 Nd0.5Sr0.5MnO3(b) 和铋基超导体 (c) 的透射电镜图像。

离子研磨可以使用两个离子枪来加快速度，或仅使用一个离子枪以保护另一侧。更高的电压、通量或角度 θ 会产生更快的研磨速率，但会对样品造成较大损伤。因此，通常在穿孔之前先用较高的电压、通量和角度 θ 进行研磨，当接近穿孔时降低这些参数以减少离子研磨损伤。

大致而言， 离子研磨速率约为每小时几微米 。应定期维护仪器以确保离子束射击在样品中心。图 6(b) 和 (c) 分别展示了用离子研磨方法制备的 Nd0.5Sr0.5MnO3 和铋基超导体样品的例子。

图 7(a) 所示的固体薄膜样品，可以通过离子研磨方法制备平面视图（图 7 ）或横截面视图（图 8 ），具体步骤如下：

1. 平面视图样品制备 。要制备平面视图 TEM 样品，将样品面朝下安装在样品架上以保护薄膜侧（图 7b ）。通过仅对基底侧进行研磨和抛光来减薄样品后，钻取直径为 3 毫米的小圆片（图 7c ）。再次只对基底侧进行凹坑研磨以保护薄膜（图 7d ）。最后，仅对基底侧进行离子研磨直至穿孔（图 7e ）。 如果薄膜相对较厚，根据需要稍微研磨薄膜侧 。

图 7 薄膜平面视图制备。 (a) 衬底上的薄膜； (b) 将样品薄膜面朝下安装在样品台上； (c) 打磨抛光衬底面后，钻取小圆片； (d) 对衬底面进行减薄； (e) 主要在衬底面进行离子减薄以保护薄膜。

2. 横截面视图样品制备 。要制备样品的横截面视图，用强力环氧树脂（如 Torr Seal 树脂）将两片薄膜样品面对面粘合在一起（图 8a ）。将样品加工成圆柱形（需要更多练习和耐心），然后将其插入外径 ≤3 毫米的管中，管内填充强力环氧树脂（图 8b ）。此时，用环氧树脂将该管（内含样品）粘在玻璃片上，以便进行下一步切片。当环氧树脂固化后，将管子切成薄片（图 8c ）。将样品安装在样品架上，通过研磨、抛光和凹坑研磨进行减薄（图 8d ）。

图 8 薄膜横截面制备过程。 (a) 将两片薄膜样品面对面粘合在一起； (b) 将样品加工成圆柱形，然后将其插入外径≤ 3 毫米的管中，管内填充树脂； (c) 将其切成薄片； (d) 通过研磨、抛光和凹坑加工使样品变薄（确保薄膜区域被凹坑处理）； (e) 离子减薄（确保穿孔发生在薄膜上）； (f) (e) 的放大图

凹坑研磨应在薄膜区域进行，以控制最终穿孔位置。应注意避免两片粘合样品断裂，如有需要，凹坑研磨后可附加一片金属垫圈。最后，对样品两侧进行离子研磨，直至薄膜处出现穿孔（图 8e ）。如果基底出现孔，继续离子研磨直至薄膜出现孔。使用光镜检查样品，确保薄膜和薄膜 / 基底界面有足够的薄区（图 8f ），如有需要继续离子研磨。

图 9 展示了使用图 8 所述方法制备横截面薄膜样品的例子。两片薄膜通过胶水面对面粘合，在 TEM 下观察时这样的间隙较大。

图 9 用图 8 方法制备的硅基双层薄膜的横截面 TEM 样品示例。

4 电解抛光

虽然离子研磨方法可用于各种样品，但整个过程耗时较长，且某些样品可能出现离子研磨引起的缺陷，如波浪状结构或有限的薄区。有时甚至可能从离子研磨样品中检测到氩 元素 。对于导电金属材料，制备具有足够薄区的良好 TEM 样品的更有效方法是电解抛光。

电解抛光的程序与离子研磨方法类似，如图 4 所示，包括切割、研磨、抛光和冲压成 3 毫米圆片。虽然金属通常具有延展性不会破碎成小块，但要尽量避免弯曲等变形，这可能引入缺陷。

3 毫米圆片样品用于双喷射电解抛光，如图 10(a) 所示。泵运行以供应电解液喷射在样品两侧进行化学蚀刻减薄。样品连接到电源的阳极（正极），并确保样品与样品架内的电极金属丝接触。 电解液是酸性溶液。根据样品类型，应选择不同的电解液成分、电压和电解液温度 。

图 10 (a) 双喷射电解抛光装置示意图； (b) 电化学过程； (c) NiTi 合金； (d, e) Ni-Mn-Sn-Co 合金。

图 10(b) 显示了电化学过程。由于样品连接到电池的阳极，金属溶解成 Mn+ 进入溶液，而喷嘴连接到阴极侧，酸溶液中的 H+ 获得电子还原成 H2 并释放到大气中。当出现穿孔时，应立即终止该过程，并尽快将带有样品架的样品从酸溶液中取出，用相同的纯溶剂（如纯乙醇或甲醇）多次冲洗直至清洁无酸。通常设备中使用 光检测器来检测穿孔 。电解抛光实验，包括电解液制备，应在通风橱中进行，操作者应穿戴实验服、手套和安全护目镜。

图 10(c) 展示了使用 20 体积 % 硫酸的甲醇溶液在约 0°C 温度下制备的 NiTi 合金样品。观察区域获得了均匀的厚度 , 可以清晰看到四种 Ni4Ti3 析出相。

在图 10(d) 中 ,Ni-Mn-Sn-Co 合金是使用 5 体积 % 高氯酸和 95 体积 %