1958年克里克提出分子生物学的中心法则，认为“遗传信息遵循从 DNA向 RNA再向蛋白质单向传递的规律”。1970年，特明 (H.M.Temin) 和巴尔的摩 (D.Baltimore) 在病毒中发现了逆转录酶，明确了以RNA为模板逆转录产生DNA的可行性和具体机制，从而打破了经典中心法则DNA向RNA单向传递的观念，推动了中心法则概念的革新，并加深了研究者对逆转录酶重要性的认识。除病毒之外，研究者在不同物种内均发现了逆转录酶的身影：真核生物中，端粒酶的逆转录酶活性对基因组稳定性至关重要，剪接体蛋白的逆转录酶功能域则能介导mRNA剪接的发生【1-2】。原核生物中，逆转录酶是多种细菌抵抗噬菌体感染的关键一环：如逆转录酶介导了CRISPR系统间隔序列的获得，反转录子（retron）中的逆转录酶能通过合成特殊的RNA/DNA/蛋白复合物来限制噬菌体扩增【3-6】。此外，原核生物中还有多种参与抵抗噬菌体感染但具体功能未知的逆转录酶（defense-associated RTs，简称为DRTs）。这其中的DRT2逆转录酶（2型DRT）主要通过逆转录酶编码基因和邻近的非编码RNA（ncRNA）发挥抵抗噬菌体感染的功能，但具体机制仍有待探索。近日，来自美国霍华德休斯研究所（HHMI）和Broad研究所的张峰实验室对DRT2进行了系统研究，并在Science发表题为Phage-triggered reverse transcription assembles a toxic repretitive gene from a noncoding RNA的论文。文章对肺炎克雷伯菌的DRT2逆转录酶系统如何发挥抵抗噬菌体感染的机制进行了解析。结果显示，噬菌体侵染时，DRT2逆转录酶会以非编码RNA为模板进行滚环式逆转录和cDNA第二链合成，最终形成的双链DNA中包含有效启动子和蛋白编码序列，双链DNA经过转录翻译产生的毒性蛋白Neo能有效阻滞细菌的生长，最终抵抗噬菌体感染。前期研究证实，大肠杆菌中表达肺炎克雷伯菌的DRT2逆转录酶系统（包括280bp的ncRNA和425氨基酸长度的逆转录酶）能抵抗T5噬菌体感染。本研究指出，面对T5噬菌体侵染时，DRT2系统的逆转录酶会以ncRNA中长度约为120bp的特定碱基序列为模板来产生cDNA。区别于传统逆转录酶的单次逆转录过程，DRT2系统采用的是滚环式逆转录，即单次逆转录之后，逆转录酶会返回120bp的模板序列起始点，进行多次“周而复始”的逆转录反应，最终产生包含多个（最多可达上百）逆转录模板重复序列的cDNA。滚环式逆转录之后，在噬菌体侵染的刺激下，cDNA第二条链合成也会开启，最终生成双链DNA。进一步研究指出，DRT2系统介导合成的双链DNA序列突变会导致抗噬菌体感染能力的丧失，这表明序列本身在抵抗噬菌体感染中至关重要。序列分析发现，DRT2系统ncRNA的模板序列中包含与细菌σ70启动子两个关键序列基序（-35和-10基序，分别位于转录起始位点上游约35bp和10bp处）相同的序列，但分别位于模板序列的5’端和3’端。-35和-10基序在ncRNA模板序列中的排布模式导致单次逆转录无法形成有效的启动子，而滚环式逆转录则可以通过模板序列的串联重复形成强大的启动子，最终激活mRNA转录。序列分析指出，该mRNA序列包含单一的开放阅读框（ORF）且没有终止密码子存在，因此可以编码超长蛋白质Neo（nearly-endless ORF）。研究发现，在mRNA序列中引入终止密码子突变会导致抗噬菌体感染能力的丧失，而功能实验也证实Neo表达对细菌生长的抑制作用，表明了Neo蛋白在抵抗噬菌体感染中的重要性。不过Neo蛋白在序列和结构上与已知的蛋白并无相似之处，因此其确切的功能仍有待后续的研究加以解决。为揭示DRT2逆转录酶介导cDNA和双链DNA生成的具体机制，研究者对DRT2逆转录酶与ncRNA形成的RNP复合物进行了结构解析。结构分析发现，在无噬菌体感染的条件下，DRT2逆转录酶会与ncRNA形成复合物，其中逆转录酶呈现出与II型内含子家族逆转录酶相似的典型“右手”结构，包括拇指 (thumb) 结构域和手指 (fingers) 结构域。此外，ncRNA的5’端非模板序列会形成发夹结构并嵌入手指结构域，3’端非模板序列经自我折叠后能与拇指结构域结合。研究还指出，ncRNA模板序列142-146位碱基会与5碱基长度的DNA引物GATAT相结合（142-146碱基被称为引物结合位点PBS）。DNA引物GATAT的合成依赖DRT2逆转录酶，并与ncRNA的3’端存在共价连接。非激活状态下，ncRNA末端的G277碱基会与ncRNA模板序列的C141碱基形成非沃森-克里克碱基配对，从而抑制逆转录过程。体外条件下，在DRT2-ncRNA相关RNP复合物中加入浓度为1mM的dNTPs后，G277-C141碱基配对会被dNTPs取代，最终有效激活滚环式逆转录发生。cDNA形成后，DRT2逆转录酶会转换为cDNA模板依赖的DNA聚合酶，从而开启第二链合成和双链DNA的生成。此外，2024年8月8日，来自美国哥伦比亚大学的Samuel Sternberg实验室在Science上发表了题为De novo gene synthesis by an antiviral reverse transcriptase的论文，同样解析了肺炎克雷伯菌的DRT2逆转录酶系统抵抗噬菌体感染的机制，其研究成果与张峰实验室的成果能够相互印证并互为补充。相关研究发表以来，Science、Nature、PNAS杂志纷纷发表评论文章，对DRT2研究的重要性进行总结和点评【7-9】。此外，虽然两文对肺炎克雷伯菌DRT2逆转录酶系统抵抗噬菌体感染的机制进行了探索，但仍存在诸多难题有待后续深入的研究加以解决，如DRT2系统感知噬菌体感染的具体机制，以及cDNA第二链合成和Neo蛋白抑制细菌生长的机制等等。张峰实验室与Sternberg实验室的两篇Science文章给整个领域带来重大的突破，并颠覆了诸多传统观念。肺炎克雷伯菌的DRT2逆转录酶系统以非编码RNA为模板，通过滚环式逆转录产生新基因并最终生成毒性蛋白Neo的机制，挑战了基因沿染色体轴线线性编码的经典范式，颠覆了研究者对非编码RNA这一基因组“暗物质”的传统认知，揭示了遗传信息在非编码RNA与DNA之间的复杂转换行为和蛋白质编码的新模式，并进一步拓展了我们对中心法则的全新认识。原文链接
doi/10.1126/science.adq0876
doi/10.1126/science.adq3977
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1. J. Lingner, T. R. Hughes, A. Shevchenko, M. Mann, V. Lundblad, T. R. Cech, Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase. Science 276, 561–567 (1997).2. W. P. Galej, C. Oubridge, A. J. Newman, K. Nagai, Crystal structure of Prp8 reveals active site cavity of the spliceosome. Nature 493, 638–643 (2013).3. L. Gao, H. Altae-Tran, F. Böhning, K. S. Makarova, M. Segel, J. L. Schmid-Burgk, J. Koob, Y. I. Wolf, E. V. Koonin, F. Zhang, Diverse enzymatic activities mediate antiviral immunity in prokaryotes. Science 369, 1077–1084 (2020).4. M. R. Mestre, L. A. Gao, S. A. Shah, A. López-Beltrán, A. González-Delgado, F. Martínez-Abarca, J. Iranzo, M. Redrejo-Rodríguez, F. Zhang, N. Toro, UG/Abi: A highly diverse family of prokaryotic reverse transcriptases associated with defense functions. Nucleic Acids Res. 50, 6084–6101 (2022).5. S. Silas, G. Mohr, D. J. Sidote, L. M. Markham, A. Sanchez-Amat, D. Bhaya, A. M. Lambowitz, A. Z. Fire, Direct CRISPR spacer acquisition from RNA by a natural reverse transcriptase–Cas1 fusion protein. Science 351, aad4234 (2016).6. A. Millman, A. Bernheim, A. Stokar-Avihail, T. Fedorenko, M. Voichek, A. Leavitt, Y. Oppenheimer-Shaanan, R. Sorek, Bacterial retrons function in anti-phage defense. Cell 183, 1551–1561.e12 (2020).7. Ilya Osterman, Rotem Sorek ,Tricking phages with a reverse move.Science0,eads3638DOI:10.1126/science.ads36388. https://www.pnas.org/post/journal-club/bacterial-defense-system-defies-central-dna-dogma9. https://www.nature.com/articles/d41586-024-01477-8
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