基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS益智仁中倍半萜类物质的分析与鉴定

益智仁为姜科植物益智 Alpinia oxyphylla Miq. 的干燥成熟果实，主要种植在广西、云南、海南等南部地区，为“四大南药”之一，目前收载于《中国药典》一部 ^[1] 。现代药理研究发现，该药具有神经保护、提高学习记忆能力、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗炎等多方面的药理活性 ^[2-5] 。

中药具有多层次、多靶点的特性，同类成分可能因其具有相似化学结构而发挥相同的作用效果，明确其化学成分，阐明主要药效物质基础对中药走向现代化、科学化有着至关重要的作用。研究表明，从益智仁中分离得到的化合物主要为倍半萜类、单萜类、二萜类、二苯庚烷类及黄酮类 ^[6-9] ，其中，倍半萜类为益智仁的主要特征化学成分，具有一定的生物活性 ^[10-11] ，且与益智仁的保健作用密切相关。但目前尚缺少对其倍半萜类化学成分进行快速分析的研究报道。因此，为进一步揭示益智仁的药效物质基础，本研究聚焦于其特征成分倍半萜类，在优化其提取工艺的基础上，利用超高效液相色谱四级杆 / 静电场轨道阱高分辨质谱（ UHPLC-Q-OrbitrapHRMS ）技术，建立系统性分析方法，根据高分辨质谱获得精准相对分子质量、碎片离子峰、保留时间及对照品信息，同时结合相关文献及数据库，实现对益智仁中倍半萜类化学成分的快速、准确鉴定。为益智仁的药效物质基础研究和质量控制水平提升奠定了基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

UHPLC-Q-Orbitrap 液相色谱 - 质谱联用系统： Ultimate 3000 超高效液相色谱仪（ Dionex 公司，美国）串联 QExactive 型高分辨质谱（ ThermoFisher Scientific 公司，美国）； JP-300B 型高速多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司）； AL104 型万分之一分析天平（瑞士 Mettler Toledo 上海有限公司）； MDS-6G 多通量密闭微波化学站（上海新仪微波化学科技有限公司）。

1.2 试剂

益智仁药材购于同仁堂，经河南中医药大学李寒冰教授鉴定为姜科山姜属植物益智 Alpinia oxyphylla Miq. 的干燥成熟果实；对照品诺卡酮（ nootkatone ，北京中科仪友化工技术研究院，批号 180308 ，经 HPLC 质量分数≥ 98% ）、 oxyphyllenone A （百灵威科技有限公司，批号 LK20T56 ，经 HPLC 质量分数≥ 97% ）、 valencene （ ChromaDex ， Inc. Irvine ，批号 00022050-007 ，经 HPLC 质量分数≥ 98% ）和 oplopanone （百灵威科技有限公司，批号 LK20T55 ，经 HPLC 质量分数≥ 96% ）。无水乙醇（分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司），甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯（美国 Fisher 公司）；水为超纯水。

2 方法

2.1 供试品溶液和对照品溶液制备

精密称取干燥的益智仁粗粉 1.0 g ，按料液比为 1 ∶ 30 的比例加入 60% 乙醇 30 mL ，提取温度 80 ℃ ，微 波提取仪功率固定为 6 W ，微波提取 10 min 抽滤，用提取溶剂定容至 40 mL ，充分摇匀后取 1 mL 溶液，置 100 mL 量瓶定容至刻度，用 0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

取诺卡酮、 oxyphyllenone A 、 valencene 和 oplopanone 对照品适量，精密称定，置于 10 mL 量瓶中，分别加入甲醇适量，制得质量浓度为 0.1 mg/mL 的单一对照品溶液，置 4 ℃ 冰箱中保存备用， 其中 0.1 mg/mL 诺卡酮对照品用于定量分析。再分 别精密量取上 述 4 个单一对照品储备液 适量，混合后加入纯甲醇稀释，最终制备成各对照品质量浓度均为 1.0 μg/mL 的混合对照品溶液 ，用于后续定性分析。

2.2 定量分析条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱为 ACQUITYUPLCBEH C ₁₈ （ 100 mm × 2.1 mm ， 1.7μm ）；以乙腈 （ A ） -0.1% 甲酸水溶液 （ B ） 为流动相，梯度洗脱： 0 ～ 3.0min ， 95%A ； 3.0 ～ 16.0 min ， 95% ～ 85%A ； 16.0 ～ 20.0 min ， 85% ～ 78%A ； 20.0 ～ 26.0 min ， 78% ～ 45%A ； 26.0 ～ 30.0 min ， 45%A ～ 100%B ； 30.0 ～ 35.0min ， 100%B ； 35.0 ～ 36.0min ， 100% ～ 5%B ； 36.0 ～ 40.0min ， 5%B ；体积流量为 0.2 mL/min ，进样量 5 μL ；柱温 40 ℃。

2.2.2 质谱条件 本实验采用 UHPLC-Q-Orbitrap 液质联用仪中的 Full-MS 一级模式对诺卡酮进行定量测定。离子源采用 HESI 源 （ heated ESI ） ，辅助气体积流量 10 μL/min ，辅助气温度 320 ℃，离子传输管温度 320 ℃；鞘气体积流量 40 μL/min ，喷雾电压 3.50 kV ；质谱分辨率 70 000 FWHM ，扫描范围 m/z 80 ～ 1200 。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围 精密量取 0.02 、 0.04 、 0.08 、 0.12 、 0.16 、 0.20 mL 诺卡酮对照品溶液（ 100 μg/mL ），分别置于 25 mL 量瓶中， 50% 甲醇定容至刻度，配制成浓度分别为 0.08 、 0.16 、 0.32 、 0.48 、 0.64 、 0.80 μg/mL 的系列梯度溶液，在“ 2.2 ”项下色谱和质谱条件下进样分析，记录峰面积。以对照品诺卡酮质量浓度为横坐标（ X ），峰面积为纵坐标（ Y ），进行线性回归，即得标准曲线方程 Y ＝ 2 × 10 ⁹ X ＋ 3 × 10 ⁷ （ R ² ＝ 0.999 ），表明诺卡酮质量浓度在 0.08 ～ 0.8 μg/mL 与峰面积线性关系良好。

2.3.2 精密度考察 取“ 2.1 ”项下供试品溶液， 在“ 2.2 ”项下条件下 连续进样 6 次， 记录峰面积。得到 诺卡酮峰面积的 RSD 值为 1.82% ，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性考察 按“ 2.1 ”项下方法平行制备 6 份供试品溶液， 在“ 2.2 ”项色谱和质谱条件下 进样分析，记录峰面积。计算得诺卡酮质量浓度，其 RSD 值为 2.93% ，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性考察 取“ 2.1 ”项下供试品溶液，分别于 0 、 2 、 6 、 10 、 12 、 24 h 室温放置后，按 “ 2.2 ”项下色谱和质谱条件 进样分析，记录峰面积。计算诺卡酮质量浓度，其 RSD 值为 1.38% 。结果表明，供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.3.5 加样回收试验 称取益智仁样品粉末 6 份，取样量分别为 1.002 2 、 1.004 8 、 1.003 6 、 1.0072 1.002 6 、 1.0098 g ，精密称定，分别加入诺卡酮对照品适量，使加入的诺卡酮含量为供试品中诺卡酮含量的 100% 。 按 “ 2.1” 项下方法平行制备供试品溶液，处理后按 “ 2.2 ”项下色谱和质谱条件 进样分析，记录峰面积。计算诺卡酮浓度，得到平均回收率为 97.20% ， RSD 为 3.46% 。结果表明，该方法下待测成分的测定准确度较好。

2.3.6 供试品的测定 按“ 2.1 ”项下方法制备供试品溶液，取适量供试品按上述方法测定诺卡酮含量，平行 3 次，再按照公式计算诺卡酮提取量。

诺卡酮提取量＝ C D V / M

C 为样品的诺卡酮质量浓度； D 为供试品稀释倍数； V 为测定总品溶液体积； M 为样品质量。

诺卡酮提取量作为响应曲面法优化的指标，用于益智仁提取条件的考察。

2.4 响应曲面法优化工艺

2.4.1 单因素考察 精密称取干燥的益智仁粗粉 1.0g ，考察料液比（ 1 ∶ 5 、 1 ∶ 10 、 1 ∶ 20 、 1 ∶ 30 、 1 ∶ 40 ），提取溶剂乙醇体积分数（ 40% 、 55% 、 70% 、 85% 、 100% ），提取温度（ 40 、 50 、 60 、 70 、 80 ℃ ），对益智仁倍半萜化合物诺卡酮提取量的影响，以确定各提取条件适宜范围，为优化微波提取益智仁工艺参数提供依据。

2.4.2 响应曲面优化试验设计 根据 Box-Behnken 中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数（ A ）、提取温度（ B ）和料液比（ C ）为考察因素，诺卡酮提取量为响应值，利用 Design-Expert8.0.6 软件对试验进行设计，优化微波提取法提取益智仁中诺卡酮的工艺参数。试验因素水平见表 1 。

2.5.1 色谱条件 色谱柱为 ACQUITY UPLCBEH C ₁₈ （ 100 mm × 2.1 mm ， 1.7 μm ） ；以 0.1% 甲酸水溶液（ A ） - 乙腈（ B ）为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为 0 ～ 2.0 min ， 95%A ； 2.0 ～ 8.0 min ， 95% ～ 50%A ； 8.0 ～ 15.0 min ， 50% ～ 25%A ； 15.0 ～ 30.0 min ， 75% ～ 100%B ； 30.0 ～ 35.0 min ， 100%B ； 35.0 ～ 36.0 min ， 75% ～ 5%B ； 36.0 ～ 40.0 min ， 5%B ；体积流量 0.2 mL/min ，进样量 5 μL ；柱温 40 ℃ 。

2.5.2 质谱条件 UHPLC-Q-Orbitrap 液质联用仪：离子源采用 HESI 源（ heated ESI ），辅助气体积流量 10 μL/min ，辅助气温度 320 ℃ ，离子传输管温度 320 ℃ ；正离子模式下：鞘气体积流量 40 μL/min ，喷雾电压 3.50 kV ；负离子模式下：鞘气体积流量 38 μL/min ，喷雾电压 2.80 kV 。扫描方式：正、负离子 Full MS/dd-MS ² 模式， Full MS 分辨率 70 000 FWHM ， dd-MS ² 分辨率 17 500 FWHM ，扫描范围： m / z 80 ～ 1 200 ，质荷比窗口宽度设置为 2 ，碰撞能梯度为 20 、 40 、 60 eV 。

2.6 益智仁倍半萜类化合物鉴定方法

按“ 2.1 ”项下方法制备供试品溶液，按“ 2.5 ”项下条件进样后，根据质谱提供的准分子离子和加合离子等信息推测并得到一级质谱的精确相对分子质量，经 Xcalibar 2.0 软件拟合分子式，并与数据库进行比对，对各色谱峰进行初步推测，再依据对照品或参考文献、 Mass Bank 数据库提供的保留时间及高能碰撞下产生的碎片离子信息，进一步推断待测化学成分。

3 结果与分析

3.1 提取工艺的优化

3.1.1 单因素考察结果 结果如图 1 所示，随着乙醇体积分数增加，提取量先大幅增加再缓慢下降，为达到较高的提取量，需进一步优化乙醇体积分数。 提取量随着温度增加而增加，在提取温度为 80 ℃时达到峰值，温度升高有助于倍半萜类化合物的提取，但过高的温度可能导致有些倍半萜化合物的结构被破坏，且考虑到安全问题，微波萃取时设定的温度不能超过提取溶剂的沸点，故试验设定 80 ℃为最大温度。提取量随着液料比的增加先缓慢增加再大幅增加，之后呈下降趋势，需进一步优化合适的液料比。

3.1.2 响应曲面优化试验结果 在单因素试验结果的基础上，采用 Box-Behnken 试验设计优化微波萃 取法提取益智仁倍半萜类的最佳条件，结果见表 2 。

利用 Design-Expert 8.0.6 对提取量试验数据进 行二项多元回归拟合，得到的二次回归方程的三维响应曲面图，结果见图 2 ～ 4 。根据响应曲面图评价各因素之间交互作用对提取量的影响强度，筛选出各考察因素的最佳取值。根据软件预测结果，并结合实际情况，确定最优提取条件为：乙醇浓度 60% ，提取温度 80 ℃ ，料液比为 1 ∶ 30 ，提取量的预测值为 1.73 mg/g 。

3.2 益智仁倍半萜类化合物的鉴定

根据“ 2.5 ”项下色质谱条件进样，在 UHPLC-Q- Orbitrap HRMS 条件下对供试品及对照品溶液进行分析，所得总离子流图（ TIC ）见图 5 、 6 。根据“ 2.6 ” 项数据分析方法，共鉴定出 24 种化学成分。根据益智仁中倍半萜类化合物的结构特点，可将鉴定出的 24 种成分分为桉叶烷型倍半萜、杜松烷型倍半萜、艾里莫芬烷型倍半萜、刺参酮型倍半萜。其中桉叶烷型 9 个、杜松烷型 6 个、艾里莫芬烷型 8 个、刺参酮型 1 个，结果见表 3 。

3.2.1 桉叶烷型倍半萜 本研究共鉴定出 9 个桉叶烷型倍半萜，包括 oxyphyllenoneB 、 (4 S ^* ,5 E ,10 R ^* )-7-oxo-tri-nor-eudesm-5-en-4β-ol 、 oxyphyllanene B 、 (5 S ,7 R ,10 R )-5-hydroxy-noreudesma-2-tien-3,11-dione 、 teuhetenone A 、 7- epi -teucrenone 、 oxyphyllanene A 、 oxyphyllenone A 、 (4a S ,7 S )-7-hydroxy-1,4a-dimethyl- 7-(prop-1-en-2-yl)-4,4a,5,6,7,-hexahydronaphthalen 2(3 H )-one 。

以 7- epi -teucrenone 为例，供试品中该化合物的 保留时间为 9.31 min 。根据一级质谱信息，其 [M ＋ H] ^＋ 分子离子峰为 m / z 235.169 3 ，由此确定相对分子质量为 234.1693 。根据二级质谱提供的离子碎片，可观察到有 H ₂ O 、 C ₃ H ₆ 、 C ₅ H ₈ 、 C ₆ H ₆ 、 CO 等中性丢失碎片，结合精确质量数以及二级高分辨质谱图，推断该化合物为 7- epi -teucrenone ，其质谱裂解途径见图 7 。

3.3.2 杜松烷型倍半萜 本研究共鉴定出 6 个杜松烷型，包括 oxyphyllenodiol A 、 oxyphyllone E 、 oxyphyllenodiolB 、 4 S -isoprophy-6-methyl-1-tetralone 、 oxyphyllenoneH 、 ketoalcohol 。以 oxyphyllenone H 为例，供试品中该化合物的保留时间为 11.15 min 。根据一级质谱信息，其 [M ＋ H] ^＋