上海交通大学药学院发表在影响因子 16.6 分的 Nature 子刊《Nature Communications》上的这篇文章，内容相当精彩，他们做的是巨噬细胞中 CUL5 对 IFNβ 的影响，让我们一同深入探究他们的研究过程。
文章所涉及的蛋白是 Cullin5，大家对它是否有印象呢？在之前的泛素化通路讲解中其实有提及（若不太清楚，可以看下《信号通路是什么鬼？》系列里相关的章节内容）。Cullin5（CUL5）作为 Cullin - RING E3 泛素连接酶 5 的关键构成部分 ，在整个研究体系中扮演着重要角色。
研究人员关注的是由呼吸道病毒感染引发的哮喘恶化问题。在哮喘发展进程里，巨噬细胞会与嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、T 淋巴细胞、肥大细胞以及上皮细胞产生复杂的免疫调节反应，其抗病毒免疫功能在调控呼吸道病毒感染、抑制哮喘发作方面起着举足轻重的作用。基于此，研究人员构建了病毒诱导的哮喘发作模型，并对肺巨噬细胞中差异表达的基因展开分析，在这个过程中，他们发现了 CUL5。
为了深入探究 CUL5 的作用，研究人员运用 Cre - LoxP 系统，对 CUL5 进行特异性敲除（关于 Cre - LoxP 系统，在《列文虎克读文献》中有详细讲解，感兴趣的话可以回顾相关内容）。结果显示，CUL5 缺失能够缓解流感诱发的哮喘发作。
这表明 CUL5 在病毒诱导的哮喘发作中，实际上起到了促进作用（这正是柯霍氏法则的验证过程，在《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《轻松的文献导读》中都有涉及相关讲解）。那么，CUL5 是借助何种机制发挥这种促进作用的呢？研究人员开展了二代测序，对可能的 CUL5 潜在下游基因进行了分析。
通过分析，他们发现在敲除 CUL5 后的差异表达基因（DEGs）中，IFN 相关基因，诸如 CXCL10、IFNA14、IFNA15 和 IFNB1 的表达均显著升高，其中 IFNβ 的变化尤为明显。当使用 IFNβ 抑制剂后，敲除 CUL5 所带来的促进表型（哮喘发作和中性粒细胞迁移表型）都出现了恢复。这也就意味着，CUL5 可能是通过抑制 IFNβ，来实现对哮喘发作和中性粒细胞迁移的促进作用。
问题接踵而至，CUL5 与转录并无直接关联，若要调控 IFNβ，必然是通过 IFNβ 的上游途径。熟悉 NOD 样受体信号通路的话（若不熟悉，可查看《信号通路是什么鬼？》系列里的 NOD 样受体信号通路和 cGAS - STING 信号通路，其中都有关于 IFN 转录激活调控的讲解），通常情况下，该通路是通过 TBK1 激活 IRF3（如下图绿框所示），进而促进 IFN 的转录（如下图蓝框所示），而 TBK1 的上游则涉及线粒体中的 MAVS（线粒体抗病毒信号蛋白，如下图红框所示）。
研究结果表明，CUL5 过表达会显著降低 RIG - I 或 MAVS 诱导的 IFNβ 荧光素酶报告活性，而 CUL5 敲减则会增加 IFNβ 荧光素酶报告活性。但值得注意的是，CUL5 并不会对 cGAS/STING、TBK1 或者 IRF3 诱导的 IFNβ 荧光素酶报告基因活性产生影响。这也就说明，CUL5 的调控作用处于 MAVS 的下游，同时又在 TBK1/IRF3 的上游（这一柯霍氏法则的验证过程十分有趣，大家若有时间，可以仔细琢磨，若不太明白，可参考《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》）。
既然 CUL5 并非直接调控 MAVS 的蛋白表达，那么它是通过何种途径抑制 MAVS 激活的呢？研究人员在查阅文献时发现，MAVS 可被多种蛋白修饰调控，例如磷酸化、泛素化和 O - GlcNAc 糖基化。
OGT（O - GlcNAc 转移酶）是目前唯一有报道称能够激活 MAVS 的 O - GlcN 糖基化的蛋白质。于是，研究人员开始分析 CUL5 与 OGT 的关系，结果显示，OGT 诱导的 MAVS 的 O - GlcN 糖基化，会被 CUL5 过表达显著抑制。这也就表明，CUL5 能够通过抑制巨噬细胞中 MAVS 的 O - GlcN 糖基化，进而抑制 IFNβ 的表达。
为了进一步明确 OGT 和 CUL5 的关系，研究人员在敲除 CUL5 后，使用了 OGT 的抑制剂 OSMI1。结果发现，敲除 CUL5 后原本得到缓解的哮喘表型明显加重（这同样是柯霍氏法则的上下游验证，但由于在这个阶段二者关系尚未完全确定，所以该验证具有一定的暂时性）。这说明肺巨噬细胞中的 CUL5 对病毒诱导的哮喘发作的调节，很可能依赖于对 OGT 的调控。
从功能层面来讲，如果 CUL5 能够调控 OGT，那么极有可能是对 OGT 进行泛素化。于是，研究人员对 CUL5 可能对 OGT 进行泛素化的具体情况展开分析，通过对 OGT 分段与 CUL5 的结合情况进行研究，找出了可能的泛素化位点，并加以验证。
最终结果表明，CUL5 确实能够对 OGT 进行泛素化修饰，这一修饰导致了 OGT 的降解。既然已经探究了 CUL5 的下游机制，那么 CUL5 的上游转录调控又是怎样的呢？研究人员通过测序分析 CUL5 潜在的上游情况。结果显示，病毒诱导的相关通路能够激活 CUL5 的表达。接着，他们用几种过敏性哮喘相关细胞因子（包括 TSLP、IL - 33、IL - 13 和 IL - 4）处理巨噬细胞，发现 TSLP 能够促进 CUL5 的表达。同时，TSLP 也会对 TBK1/IRF3 以及 IFNβ 的表达产生影响（若不太清楚，可再回顾《信号通路是什么鬼？》系列里相关的通路内容）。
哮喘加重的原因在于，CUL5 对 OGT 进行泛素化修饰，致使 OGT 表达下调。OGT 表达下调后，MAVS 的 O - GlcN 糖基化随之下降，进而抑制了下游包括 TBK1 和 IRF3 的激活，阻碍了 IFNβ 的表达。既然 IFNβ 处于通路的最末端，那么 IFNβ 本身能否缓解病毒诱导的哮喘加重呢？研究人员对模型施用 IFNβ 后，果然发现病毒诱导的哮喘症状得到了缓解。
最终形成了如下所示的示意图：
这篇文章着实不易，在分析 CUL5 如何调控 IFNβ 转录的调控通路时，运用柯霍氏法则进行的验证过程就已经相当出色。后续他们又深入研究了 CUL5 通过 OGT 对 MAVS 的 O - GlcN 糖基化调控，以及对 MAVS 激活的影响，从整体来看，这已经是一篇相当优秀的文献。倘若能够将 CUL5 对 OGT 的泛素化修饰研究拓展到最终的通路中（比如对修饰位点进行突变，分析其对 IFNβ 转录的影响，或者分析 MAVS 的 O - GlcN 糖基化影响），而不只是局限于泛素化修饰本身的检测，或许这篇文章还能更上一层楼。好了，今天就分享到这里，若感兴趣，一定要阅读原文，希望对大家有所帮助。
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