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ELISA全攻略：从入门到精通的实战经验分享

生物制品圈 · 公众号 · 生物 · 2025-02-05 13:31

正文

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是生物医学领域应用最广泛的技术之一，其高灵敏度、高通量和低成本的特点使其成为蛋白质检测的“金标准”。然而，看似简单的ELISA实验背后却暗藏诸多技术细节，稍有不慎便可能导致假阳性、高背景或重复性差等问题。本文基于笔者十余年的实战经验，结合数百次实验优化案例，系统解析ELISA的核心原理、操作技巧、故障排除策略及前沿进展，助您避开“踩坑”陷阱，快速获得可靠数据。

第一章 ELISA基础与类型选择：明确目标是成功的第一步

1.1 基本原理：抗原-抗体的精准“锁钥配对”

ELISA的核心机制是利用抗原-抗体的特异性结合，通过酶标二抗催化显色反应，将不可见的免疫反应转化为可定量的光信号（OD值）。以经典的夹心法ELISA为例，其流程可概括为：
包被→封闭→样本孵育→检测抗体→酶标二抗→显色→终止→读数

1.2 四大类型的选择策略

案例分享 ：
某实验室检测血清中COVID-19 IgG抗体时，因选择直接法导致假阴性率高达30%，后改用间接法并优化封闭剂（5%脱脂牛奶+0.05% Tween-20），灵敏度提升至95%以上。

第二章实验设计关键点：细节决定成败

2.1 抗体配对：夹心法的“黄金组合”

捕获抗体 ：选择高亲和力（Ka>10^9 M-1）、识别线性表位的单抗
检测抗体 ：推荐使用识别构象表位的多抗，避免空间位阻
验证方法 ：通过Western Blot验证抗体特异性，使用棋盘滴定法优化浓度比例

经验公式 ：
捕获抗体浓度（μg/mL）=（分子量×10^6）/(6.02×10^23×包被体积×表面积) ×10
（以96孔板为例，通常1-10 μg/mL为优化范围）

2.2 样本处理：避免假结果的隐形杀手

血清/血浆 ：4℃静置2小时充分凝血，3000×g离心15分钟去除纤维蛋白
细胞裂解液 ：建议使用RIPA缓冲液（含1%蛋白酶抑制剂），超声处理3×5秒（冰上操作）
组织匀浆 ：按1:5（w/v）加入PBS，玻璃匀浆器研磨后过100μm筛网

重要提醒 ：
避免使用含有NaN3的保存液（会抑制HRP活性），EDTA浓度需<5 mM（防止金属酶失活）

第三章操作技巧与优化：从“能做”到“做好”的飞跃

3.1 包被环节的“三度”控制

温度：4℃过夜包被优于37℃ 2小时（减少蛋白变性）
pH值 ：碳酸盐缓冲液（pH 9.6）可使多数抗体通过疏水作用吸附
均匀度 ：使用排枪垂直加样，加样后轻敲板侧壁消除气泡

3.2 封闭剂的选择艺术

优化案例 ：

检测脑脊液中Aβ42时，使用0.5% Casein + 0.1% CHAPS封闭液，背景值降低40%，信噪比提升3倍。

第四章常见问题与解决方案：实战中的“救火指南”

4.1 高背景信号的7种可能原因

洗涤不充分 → 增加洗涤次数至5次，每次浸泡1分钟
封闭不完全 → 改用组合封闭剂（如1% BSA + 0.1% Tween-20）
抗体浓度过高 → 进行梯度稀释（建议从1:1000开始）
酶标板质量问题 → 选择高结合力板（如Corning #3590）
显色时间过长 → 设置动态监测，OD值达1.5时立即终止
样本溶血 → 加入1 mM PMSF抑制蛋白酶
室温波动 → 使用预温育板架（37℃±0.5℃）

4.2 标准曲线拟合失败的修正策略

R²值<0.95 ：检查稀释梯度是否跨越检测范围（建议覆盖3个数量级）
“钩状效应” ：样本浓度过高时需稀释后复测
平台期过早 ：缩短显色时间或降低TMB底物浓度

数据处理技巧 ：
推荐使用四参数逻辑回归（4-PL）拟合，公式：

其中A为最大OD值，D为最小OD值，C为EC50，B为斜率因子

第五章前沿进展：ELISA技术的“未来式”

5.1 数字化ELISA：单分子检测时代

Simoa技术 ：通过微孔阵列捕获单个免疫复合物，灵敏度达fg/mL级（如Quanterix平台）
电化学ELISA ：使用纳米金颗粒标记，检测限比传统法低100倍

5.2 高通量创新方案

微流控芯片ELISA：样本消耗量<1 μL（适用于稀有样本）
多重检测技术：Luminex磁珠系统可同时检测100+指标

5.3 自动化革命

全自动ELISA工作站（如Tecan Freedom EVO）实现“样本进-结果出”
AI辅助判读：DeepELISA算法可自动识别异常孔并重新计算

参考文献

Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). J Immunol . 1972;109(1):129-135.
Lequin RM. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clin Chem . 2005;51(12):2415-2418.
Rissin DM, et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat Biotechnol . 2010;28(6):595-599.
Crowther JR. The ELISA Guidebook . 2nd ed. Humana Press; 2009.
Bio-Rad Laboratories. ELISA Technical Handbook . 2023 Edition.

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