蝙蝠葛碱对肝癌Huh7细胞增殖和凋亡的作用及机制研究

蝙蝠葛碱（ dauricine ， DC ）又名北豆根碱，是从防己科植物蝙蝠葛 Menispermum dauricum DC. 的干燥根茎中提取的苄基四氢异喹啉类生物碱，气味微苦，临床用于治疗扁桃体炎、咽喉肿痛、牙龈肿痛等 ^[1] 。北豆根的主要药用成分为生物碱，总碱含量在 1% 以上，其中含量最高的为 DC ^[2] 。 DC 具 有明确的抑菌抗炎作用，近年来还发现其具有抗心律失常、抗氧化损伤和抗肿瘤作用 ^[3-6] 。

原发性肝癌是全球导致死亡的第 2 大肿瘤，其中 70% ～ 85% 为肝细胞肝癌（ hepatocellular carcinoma ， HCC ） ^[7-8] 。肝癌的发生和演进是一个多阶段、多系统、多基因参与的复杂过程，选择性阻断肿瘤细胞信号传导通路，破坏其自控性生长调节机制为肿瘤研究领域的热点 ^[9] 。

Hedgehog 信号通路在果蝇中首次被发现，并已证明从果蝇到人类普遍存在 ^[10] 。其在多种生理过程如哺乳动物胚胎发育、组织分化及肿瘤形成等过程中都发挥关键作用 ^[11] 。 Hedgehog 通路由 Hedgehog 配体、 2 个跨膜蛋白受体 Ptched （ Ptch ）和跨膜蛋白 Smoothened （ SMO ）以及核转录因子 GLi 蛋白等组成，因此 SHH 、 PTCH1 、 GLi1 和 SMO 基因及蛋白的表达水平是反映 Hedgehog 信号通路活性的可靠 指标 ^[12] 。近几年的研究表明，在多种恶性肿瘤中都存在着 Hedgehog 信号通路的异常激活，如肝癌、肺癌、甲状腺癌、前列腺癌、胃癌等，提示 Hedgehog 信号通路在肿瘤发生、发展过程中起到重要作用 ^[13-17] 。

本实验采用不同质量浓度的 DC 处理肝癌 Huh7 细胞，研究其对 Huh7 细胞增殖、凋亡的影响，并研究 DC 是否通过 Hedgehog 信号通路发挥作用，为肝癌的治疗提供相应的理论依据。

1 材料

1.1 细胞株

Huh7 细胞由郑州大学第一附属医院肝病中心实验室液氮冻存。

1.2 药品与试剂

DC 购自上海融禾医药公司（批号 BR-06272, 质量分数 ＞ 99.2% ， Sigma-Aldrich 公司）；胎牛血清购自 Gibico 公司； RPMI 1640 培养基由 Hyclone 公司生产；四甲基偶氮唑蓝（ MTT ）购自碧云天公司； Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒购自 Becton Dickinson 公司；二甲基亚砜（ DMSO ）和总 RNA 抽提试剂 Trizol 购自 Invitrogen 公司；逆转录试剂盒、 BCA 蛋白定量试剂盒购自 Thermo Fisher 公司； Real-time PCR 定量 mix 购自 Roche 公司；聚偏二氟乙烯膜（ PVDF ）购自 Millipore 公司；兔抗人 β-actin 多克隆抗体购自 Santa Cruz 公司；兔抗人 PTCH1 、 GLi1 、 SMO 多克隆抗体购自 Sigma-Aldrich 公司；兔抗人 cleaved Caspase-3 多克隆抗体购自 Cell Signal Technology 公司；鼠抗人 Caspase-3 、 Bcl-2 单克隆抗体购自 Abcam 公司；羊抗兔和羊抗鼠二抗为北京中山金桥公司生产。

1.3 仪器

CO ₂ 培养箱购自 Thermo Fisher 公司；流式细胞 仪购自美国 BD 公司；酶标仪购自 Bio-Rad 公司， Real-time PCR 仪购自 Roche 公司； GEImage Quant LAS 4000 mini 超灵敏化学发光成像仪购自 GE 公司。

2 方法

2.1 细胞培养和药物配制

Huh7 细胞用含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基，在 5% CO ₂ 、 37 ℃ 、饱和湿度的培养箱培养， 0.25% 胰酶消化传代， 2 ～ 3 d 传代 1 次。实验采用对数生长期细胞。 DC 干粉以 DMSO 溶解配制成 8 mg/mL 的储存液，并分装冻存于 −20 ℃ ，使用时以培养基稀释至所需质量浓度。

2.2 MTT 实验检测细胞增殖

Huh7 细胞接种于 96 孔板（ 8 × 10 ³ 个 / 孔），过夜培养后分为对照组和 DC 低（ 2 μg/mL ）、中（ 4 μg/mL ）、高（ 8 μg/mL ）质量浓度组，每组 6 个复孔，各组分别加入 DMSO 和相应质量浓度的 DC 。于培养 24 、 48 、 72 h 分别加入 MTT 溶液 20 μL （ 5 mg/mL ）继续培养 4 h 。弃去上清，每孔加入 150 μL DMSO ，避光震荡 10 min 摇匀。使用 Bio-Rad 酶标仪于 490 nm 波长测定各孔吸光度（ A ）值，计算细胞增殖抑制率。

增殖抑制率＝ 1 － A _给药 / A _对照

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡

于 6 孔板中接种 Huh7 细胞（ 5 × 10 ⁶ 个 / 孔），分组同“ 2.2 ”项下，每组加入 DMSO 和相应质量浓度的 DC 。 48 h 后收集细胞，按照 Annexin V-FITC/PI 试剂盒说明，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.4 Real-time PCR 检测相关基因表达水平

Real-time PCR 检测 PTCH1 、 GLi1 、 SMO 、 SHH 、 mRNA 表达。于 12 孔板中接种 Huh7 细胞（ 2 × 10 ⁶ 个 / 孔），分组同“ 2.2 ”项下，每组 3 个复孔，各组分别加入 DMSO 和相应质量浓度的 DC 。处理 24h 后弃去上清，每孔加入 0.5 mL Trizol 处理细胞，提取总 RNA ，逆转录成 cDNA ，以 cDNA 为模板，使用含 SYBR Green 定量试剂盒进行 real- time PCR 反应。反应参数： 95 ℃ 、 30 s ， 1 个循环； 95 ℃ 、 5 s ， 60 ℃ 、 10 s ， 40 个循环。目的基因相对表达量的计算方法为 2 ^{−ΔΔ C t} ， β-actin 为内参，引物序列见表 1 。

2.5 Western blotting 实验检测相关蛋白表达水平

检测 Huh7 细胞中 PTCH1 、 GLi1 、 SMO 、 SHH 、 Caspase-3 、 Bcl-2 和 cleaved Caspase-3 蛋白的表达， 以 β-actin 为内参。于 6 孔板中接种 Huh7 细胞（ 5 × 10 ⁶ 个 / 孔），分组同“ 2.2 ”项下，各组分别加入 DMSO 和相应质量浓度的