【业务介绍】IP-MS/Co-IP

蛋白质之间的相互作用在细胞内信号传导、代谢调控和基因表达等生物学过程中起着至关重要的作用，因此通过分子生物学实验揭示蛋白质的互作网络，有助于研究者深入解析细胞内的关键信号通路，明确目的基因的功能。IP-MS是常用的在植物体内筛选互作蛋白的有效方法，Co-IP则常用于筛选后的蛋白之间的点对点验证。

免疫沉淀结合质谱（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry, IP-MS）是一种结合了免疫沉淀和质谱分析的强大技术。该技术是在天然条件下从植物细胞裂解物中捕获蛋白质复合物的经典方法，不仅能够识别与目标蛋白质相互作用的蛋白质，还可以解析这些相互作用的动态变化和修饰状态。

以靶蛋白为诱饵，将结合了靶蛋白特异性抗体或标签抗体的beads与细胞总蛋白进行孵育，促进免疫复合物的形成。将免疫复合物从beads上洗脱后进SDS-PAGE以分离蛋白，然后通过液相色谱-质谱（LC-MS）对酶解后的肽段进行分析，从而鉴定出与目的蛋白相互作用的未知蛋白。

图1 IP-MS结合原理。图片来源：伯远生物。

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在进行IP-MS实验时，一般推荐使用稳定转化的材料，能更加准确地反映植物体内真实的相互作用。但是，对于一些没有稳定转化体系的物种，也可以通过瞬时转化来进行实验。下面展示的是基于原生质体瞬时转化体系的IP-MS实验流程图：

图2 基于原生质体瞬时转化体系的IP-MS实验流程图。图片来源：伯远生物。

2021年２月，中国科学院植物研究所王雷课题组在 The EMBO Journal 杂志上发表了一篇题“Clock component OsPRR73 positively regulates rice salt tolerance by modulating OsHKT2;1 -mediated sodium homeostasis”的研究论文， 揭示了昼夜节律与水稻耐盐性之间的联系，以及水稻生物钟正向调控水稻耐盐性的机制。在该论文中，作者通过IP-MS对OsPRR73的相互作用蛋白进行鉴定（图3），并结合其他实验发现HDAC10可以与OsPRR73相互作用，形成转录抑制复合物，抑制 OsHKT2;1 的表达。

图3 IP-MS鉴定的OsPRR73潜在相互作用蛋白(Wei et al., 2021)。

Q1：IP-MS可以在那些物种里面做？

A：目前我司可提供烟草叶片瞬转，水稻、拟南芥、玉米、小麦原生质体瞬转和HEK293T哺乳动物工具细胞瞬转等物种筛选蛋白之间的互作，非上述物种的可以在亲缘关系相近的物种中做，或者提供稳转材料。

Q2：IP-MS需要准备多少样本量？

A：本实验需要保证足够的蛋白浓度才能维持原本存在的蛋白互作状态，尤其当蛋白丰度较低、相互作用力不强、使用不易提蛋白组织等情况时。而且Co-IP的实验条件往往需要反复摸索。因此IP-MS实验需提供细胞＞2×10 ⁷ ，动物组织＞0.5g，植物组织＞3g，并且须注意采集后液氮速冻、-80℃保存和避免反复冻融。

Q3：IP-MS需要客户提供什么？

A：1）客户有稳转材料，可以直接提供稳转材料； 2）客户有现成可以做IP-MS的载体，可以提供载体，并告知抗性与检测标签； 3）客户提供基因序列与用于扩增目的基因的模板，由我司构建载体； 4）客户提供基因序列，由我司全基因合成并构建载体。

Q4：质谱检测什么时候定量什么时候不定量？

A：根据自己的实验需要来选择，如果要知道两者之间的差异蛋白（如用质谱比较野生型和转基因株系之间的差异蛋白来鉴定与目的蛋白相互作用）时需要定量，如果只是想知道所提供的材料里面的蛋白种类则不需要定量。

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1 .实验报告；

2.输出结构.pdf文件（输出结果的结构展示）；

3.生物信息学分析（蛋白鉴定、定量信息及基于蛋白定量信息的差异蛋白筛选、PCA分析和聚类分析结果）。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是一种基于免疫学原理的生物化学技术，用于研究蛋白质之间的相互作用。该技术的核心原理是利用与目标蛋白质特异性结合的抗体来识别、富集以及分析与其相互作用的蛋白质。Co-IP技术因其高特异性和可靠性而备受研究者的青睐。

基于抗原-抗体特异性结合的原理，使用靶蛋白特异性抗体或标签抗体捕获样品中的靶蛋白，形成抗体-靶蛋白复合物，然后利用能够与抗体结合的beads来固定和沉淀复合物，同时与靶蛋白相互作用的蛋白也会被沉淀下来，最后洗去与靶蛋白相结合的非特异性蛋白，再通过SDS-PAGE进行分析、Western blot检测。

图4 Co-IP结合原理。图片来源：伯远生物。

图5 瞬时转化烟草叶片进行Co-IP实验的流程图。图片来源：伯远生物。

图6 瞬时转化原生质体进行Co-IP实验的流程图。图片来源：伯远生物。

2021年10月，中国科学院分子植物科学卓越创新中心何祖华、杨卫兵和钟祥斌课题组在 Cell 杂志上发表了一篇题为“Ca ²⁺ sensor-mediated ROS scavenging suppresses rice immunity and is exploited by a fungal effector”的研究论文。作者为了阐明ROD1介导的免疫抑制的分子机制，首先以ROD1为诱饵，利用酵母双杂筛选出了可能与ROD1相互作用的蛋白APIP6、RIP1。然后利用Co-IP进一步证实了ROD1与这两个E3泛素连接酶APIP6、RIP1的互作关系（图7）。

图7 通过Co-IP在本氏烟叶片中验证ROD1与APIP6、RIP1的相互作用(Gao et al., 2021)。由于全长APIP6和RIP1蛋白在植物中的不稳定性，因此使用缺少RING结构域的蛋白进行相互作用验证。

Q1 ： 用 Co-IP 验证出两个蛋白互作，但是其他验证方式却不互作，是不是 Co-IP 不可靠？

A：Co-IP可以验证两个蛋白之间互作的关系，用其他验证方式却不互作可能是因为Co-IP中存在中间蛋白参与互作导致的。

Q2 ： 为什么其他方式能验证出两个蛋白之间有相互作用，用 Co-IP 却没有验证出来？

A：Co-IP是验证蛋白之间相互作用的经典方法，但是有一定的灵敏度，对于有些弱相互作用或由于蛋白表达量太低而检测不出来的，属于正常范畴。

Q3 ： Co-IP 中的 Input、IP、IB 分别是指什么？

A：Input指的是总蛋白，属于阳性对照，IP是用相应的抗体沉淀相应的蛋白，IB是指对抗体沉淀后的蛋白进行WB检测。

Q4 ： Co-IP 实验对抗体有什么要求？

A：若是自身蛋白抗体，抗体需要达到IP级别，并且需要测试其效价，商业化的标签抗体也需要达到IP级别。

Q5 ： Co-IP 实验如何避免出现假阳性？

A：1）若抗体浓度高，则降低抗体浓度；2）若抗体特异性不好，则更换抗体；3）若蛋白丰度非常高，则可以加大洗涤次数。

Q6 ： Co-IP 中的 Protein A/G beads有何作用？

A：Protein A/G能特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段，因此能和抗体结合，而抗体与目标蛋白结合，目标蛋白和相互作用的蛋白结合。

Q7 ： Co-IP 实验中阴性对照的意义是什么？

A：排除非特异性蛋白的结合。

Q8 ： Co-IP 实验中如何去除重链、轻链的影响？

A：用目前商业化的纳米抗体可以有效避免，或者在WB的过程用特异性二抗去排除。此外IP的抗体和WB的抗体最好是不同种属的。

Q9 ： Co-IP 中没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或检测得到的信号太弱的原因有那些？

A：1）裂解液中的去垢剂浓度太高：此时降低去垢剂浓度或更换去垢剂种类；2）受蛋白的亚细胞定位影响：应重新选择裂解液配方来释放目的蛋白；3）蛋白与蛋白之间的相互作用太弱或不太稳定：应选择亲和力更高的抗体以捕获更多的目的蛋白，从而捕获更多的相互作用蛋白；4）过表达提高目的蛋白的含量：选择目的蛋白或相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验。