摘要：抗体-药物偶联物（ADCs）是一类生物制药，其中细胞毒性剂与单克隆抗体（mAbs）偶联，允许靶向药物传递。目前的异质性ADCs（在随机可变位置偶联）存在稳定性、可重复性、效力等问题。最近的进步已经导致了通过位点特异性偶联的均质ADC制剂的开发，允许控制药物-抗体比率。这些方法增加了ADC制剂的治疗窗口、效力和批次间一致性。抗体在Fc区域携带一对异质性N-糖链，这对抗体功能至关重要。通过糖基工程已经实现了药物偶联，包括使用内切β-N-乙酰葡萄糖胺酶（ENGases）和单糖基转移酶突变体。在本文中，我们总结了不同的糖基工程方法用于抗体-药物偶联，并讨论了它们对下一代均质ADCs开发的优势。
1.引言
抗体-药物偶联物（ADCs）是通过将细胞毒性剂与单克隆抗体（mAbs）偶联而制备的一类靶向疗法。截至2021年1月，已有九种ADCs正在使用，超过80种ADCs处于临床试验中。目前商业化的ADCs是异质性的（在随机可变位置偶联），因为有效载荷是通过抗体的氨基或硫醇基团偶联的，导致药物-抗体比率和连接位点的变化。这种非选择性方法不是最优的。异质性ADCs存在可重复性、效力和稳定性问题，可能带来显著风险，阻碍了临床开发。因此，目前期待新一代改进的ADCs。为了最大化下一代ADCs的可重复性、耐受性、效力和治疗窗口，非常需要开发能够产生均质ADC制剂的方法。
IgG普遍在Fc区域的Asn297上携带一对N-糖链，由于其复杂的生物合成过程，这在很大程度上是异质性的。糖链结构在抗体功能中起着至关重要的作用。例如，Fc N-糖链上核心岩藻糖的缺失可导致抗体依赖性细胞毒性（ADCC）增强100倍。在非人细胞中生产的mAbs表达的糖链结构在人类血清IgGs中不常见，导致严重的免疫原性。此外，据报道，商业化的曲妥珠单抗的N-糖链结构在不同批次之间存在差异。因此，调节Fc N-糖链结构非常重要。最近，使用内切β-N-乙酰葡萄糖胺酶（ENGase）突变体的IgG糖基工程变得可能，这可以提供具有均质糖链结构的抗体制剂。这种方法的扩展将允许生产具有糖链连接的均质ADC制剂。在N-糖链位点偶联有效载荷是理想的，因为Fc N-糖链位于Asn297，远离抗原结合区域。因此，这种糖链的修饰不会影响抗原结合能力。
最近，我们通过ENGase突变体介导的糖基工程实现了均质ADC制剂的制备。除了ENGases，还有其他方法可以将有效载荷偶联到抗体的糖基部分。在这里，我们总结了基于糖基工程的均质ADC制备方法，并特别关注我们的方法。
Shino Manabe教授于1996年在东京大学Kenji Koga教授的指导下获得了博士学位。在此期间，她加入了哥伦比亚大学Gilbert Stork教授的研究小组，担任研究员，并在天然产物合成领域工作。之后，她转到RIKEN工作，并在日本科学技术振兴机构的胚胎科学与技术（PRESTO）计划中任职。在那段时间里，她获得了日本药学会青年科学家奖。目前，她是星药科大学全职教授，同时在东北大学药学研究生院及药学部药物开发研究中心任职。她的主要研究兴趣涉及糖缀合物合成技术的开发展。
山口义树教授于1998年在日本东京大学药学研究生院（导师为Isao Shimada教授和Yoji Arata教授）获得了博士学位。他继续在同一研究小组作为博士后研究员，然后作为研究员进行研究。从2001年到2007年，他在名古屋市立大学（Koichi Kato教授）担任讲师，之后他转到RIKEN，先是作为结构糖生物学团队的团队领导（2007-2017年），然后在合成细胞化学实验室继续研究（2017-2018年）。2018年，他转到东北医疗药科大学，担任他目前的教授职位。他目前正在研究糖缀合物和糖结合蛋白的三维结构和功能。
2.使用ENGase/ENGase突变体的抗体糖基工程
2.1.ENGase突变体的作用
ENGases是水解酶，能够切断N-糖链N,N'-二乙酰壳二糖核心中的β-1,4-糖苷键。从不同来源分离出多种ENGases。ENGases催化的水解机制涉及壳二糖核心中第二个GlcNAc残基的邻近基团参与（方案1）。在活性位点中氨基酸的位移产生了ENGase突变体，这些突变体抑制了糖链水解活性，但仍具有糖链转移活性（表1）。因此，ENGase突变体将糖链整体转移到糖链截短的抗体上，从而生产具有均质糖链结构的抗体。在ENGases中，EndoS和Endo S2突变体特别用于抗体糖链重塑，因为它们对IgG具有高亲和力（方案2）。
方案 1. EndoS 和 Endo S2 内切酶的糖链水解机制。方案 2. 使用内切酶/内切酶突变体制备具有均质糖链结构的抗体的策略示意图。括号内显示的是异质性组分。首先，在水解过程中通过底物辅助催化生成一个恶唑啉中间体。高能态的糖链恶唑啉是ENGase突变体介导的糖链转移反应的良好糖链供体。因此，在水解原始异质糖链后，EndoS/Endo S2突变体和糖链恶唑啉可以结合，介导后者转移到IgG分子上，从而提供具有均质糖链结构的抗体。准备的具有均质糖链的抗体揭示了糖链的重要性以及糖链结构与抗体功能（包括稳定性、ADCC活性和与Fcγ受体的结合能力）之间的关系。
2.2.ENGase突变体介导的糖链转移反应条件
ENGase突变体介导的糖链转移反应的条件必须仔细优化。在没有ENGase突变体的情况下，糖链恶唑啉在碱性条件下与赖氨酸氨基基团反应（方案3）。我们通过亲水作用色谱（HILIC）的UPLC分析实现了这一副反应的实时监测。这种方法可以用来监测和优化反应。优化后，我们将反应介质的pH设定为6.5。在这些条件下，氨基被质子化以减少亲核性。由于糖链恶唑啉在pH 6.5下不稳定，因此在反应过程中分批添加以保持足够的浓度。
此外，选择合适的ENGase突变体是一个重要问题。虽然Endo M N175Q经常用于GlcNAc肽的糖链转移，但这种突变体对携带核心岩藻糖的抗体的糖链转移效果不佳。我们使用了Endo CC1，它具有与Endo M N175Q相似的特性，但热稳定性更高，用于添加到缺乏核心岩藻糖的抗CCR4抗体。
2.3.高效糖链转移的方法
为了避免副反应，我们使用唾液酸糖肽（SGP）1作为供体，而不是高反应性的恶唑啉2。因为SGP 1不是过渡态模拟化合物，其反应性与恶唑啉2相比低。因此，糖链转移需要高浓度的SGP 1。另一种避免副反应的方法是结合两种ENGase突变体和SGP 1（方案4）。在这两种ENGase突变体中，Endo M N175Q用于生成活性糖链中间体，推测是恶唑啉，尽管确切结构未被鉴定。生成的活性糖链中间体使用ENGase突变体EndoS D233Q进行原位糖链转移。这一程序降低了恶唑啉浓度，从而抑制了副反应。这种方法的其他优点是避免了相对不稳定的恶唑啉的分离，并且恶唑啉的制备和糖链转移可以在一锅操作中进行。
方案 4. 通过结合两种内切酶突变体，在一锅操作中原位生成氧化哌啶酮和糖链转移反应。尽管ENGase突变体的水解活性受到抑制，但由于剩余的水解活性，糖链转移产率有时仍然不足。使用固定化ENGase突变体的流动化学是提高产率的关键技术。虽然使用固定化Endo M N175Q的流动反应产率可以高于90%，但在静态条件下产率低于90%。固定化的ENGase可以回收利用，这也是一个优势。
2.4.均质ADC的制备
基于上述协议，通过携带有效载荷偶联功能团的糖链恶唑啉，可以准备均质ADCs（方案5）。在唾液酸糖链3的唾液酸的羧基上，通过使用苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基磷酰六氟磷酸盐（PyBOP）形成酰胺键引入叠氮基团。然后，根据Shoda协议在水中通过脱水反应制备恶唑啉4（方案6）。最后，需要进行双正交反应以将有效载荷添加到连接位点，从而实现均质ADC的制备。
方案 5. 糖链偶联均质ADCs制备策略的示意图。括号内显示的是异质性组分。
曲妥珠单抗是一种与HER2抗原结合的mAb，广泛用于治疗乳腺癌和胃癌。曲妥珠单抗也常在ADC研究中使用。通过EndoS D233Q将携带叠氮的糖链转移到曲妥珠单抗后，每个抗体上安装了四个叠氮基团。通过与张力炔烃的双正交反应，将带有溶酶体酶cathepsin B可切割的Val-Cit（瓜氨酸）连接子和单甲基auristatin E（MMAE）5载荷偶联（图1）。MMAE是一种有效的抗有丝分裂药物，源自海洋生物中的肽类，已被固定在琼脂糖上，并且与糖结合域融合的EndoS D233和D233Q已被固定在纤维素上。如上所述，这些固定化的ENGase突变体有效地转移糖链。固定化野生型EndoS与上述ENGase突变体的结合允许进行抗体糖基工程，而无需纯化糖链截短的抗体。此外，在ADC brentuximab vedotin中，并且目前在几种使用的ADCs中使用。
我们通过UPLC、MS和肽图谱确认了所准备ADC的均质性。完整MS清楚地显示了4:1的药物-抗体比率。流式细胞仪表明，ADC的结合亲和力与天然曲妥珠单抗相同。此外，ADC对高HER2表达的乳腺癌SK-BR-3细胞或胃癌OE-19和N-87细胞系具有高度的细胞毒性。特别是，SK-BR-3细胞的IC50与MMAE本身相同（0.3 nM）。另一方面，ADC对低HER2表达的乳腺癌MCF-7和胃癌MKN-45细胞系没有细胞毒性。这些结果证明了糖链偶联ADC的有效性。
已经报道了用于均质糖链偶联ADC制备的类似方法。在二醇基团氧化裂解后，使用腙键引入叠氮基团（图2）。糖链转移后，有效载荷6被偶联，ADC对SK-BR-3细胞系显示出强大的细胞毒性。
心房利钠肽用于治疗充血性心力衰竭等心血管疾病。然而，心房利钠肽在体内的半衰期很短（2.4±0.7分钟）。通过EndoS D233Q/Q303 L突变体的糖基工程，将PEG 7与心房利钠肽偶联。ADC的半衰期延长至14.9天，并且降低血压的效果维持超过28天。
3.抗体糖基工程的其他方法
3.1.1,2-顺式二醇的氧化断裂
由于岩藻糖和唾液酸含有邻位顺式二醇，通过NaIO4的选择性氧化断裂可以产生无甲壳类动物Dolabella auricularia的甲壳素，这些甲壳素被称为多拉定。可被组织蛋白酶裂解的连接子首次由研究小组开发。
由于抗体没有甲酰基团，生成的甲酰基团可以作为在糖基部分专一性地固定载荷的官能团。唾液酸的无环二醇基团与其他单糖相比具有更大的灵活性和无阻碍性；因此，唾液酸可以在相对温和的条件下被氧化。然而，抗体通常含有低水平（<10-14%）的唾液酸。为了增加唾液酸含量，可以通过商业可获得的半乳糖基转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶，使用尿苷二磷酸半乳糖（UDP-半乳糖）和胞苷酸唾液酸（CMP-唾液酸）作为糖基供体，来延长寡糖链。使用NaIO4处理HPCM2（一种抗磷脂IgM），用于糖链125I和111In的偶联。这些偶联抗体被证明保留了它们的结合亲和力。相比之下，通过赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸的偶联降低了它们的亲和力。体内生物分布和肿瘤定位数据表明，通过糖链放射性标记的抗体可能对免疫扫描成像有益。
这些方法要求抗体长时间暴露于低pH值、剧烈的氧化条件，以及对氨基酸残基（如半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸）的修饰，这可能会引起潜在问题。
3.2.唾液酸转移的修饰
由于唾液酸转移酶对唾液酸C-5和C-9位置的修饰具有耐受性，可以将9-叠氮基团功能化的CMP-唾液酸转移至糖链（方案7）。利用唾液酸转移酶的耐受性，可以在糖链上引入叠氮基团以备ADC制备。为了增加唾液酸含量，使用半乳糖基转移酶和UDP-半乳糖添加半乳糖。然后，使用重组α-2,6-唾液酸转移酶I和9-叠氮-CMP-唾液酸，将带有叠氮基团的唾液酸并入。二苄基环辛基羰基（DIBO）基团中的炔烃与叠氮烃通过无铜Huisgen反应（炔烃-叠氮环加成）反应，并可用于生产生物缀合物。修饰抗体的唾液酸部分C-9的叠氮基团可以使用FITC、生物素或水合霉素等DIBO修饰的反应。制备的ADC在体内以剂量依赖性方式显示出细胞毒性。
方案 7. 使用9-叠氮基唾液酸和唾液酸转移酶的均质糖链偶联ADC。括号内显示的是异质性组分。
3.3.改良的半乳糖转移
由于半乳糖基转移酶能够容忍改良的半乳糖基供体结构，因此可以通过半乳糖基转移酶添加带有功能团的半乳糖。C2-酮半乳糖或叠氮-GalNAc已通过β(1,4)Gal-T1-Y289L半乳糖基转移酶突变体并入。半乳糖被半乳糖苷酶处理和β(1,4)Gal-T1-Y289L转变为带有叠氮基团的GalNAc（方案8）。然后，放射性同位素或细胞毒性化合物可以添加到叠氮基团上。还报道了另一种方法（方案9），在EndoS处理后，叠氮-GalNAc被转移到GlcNAc上，产生短糖链结构。这两种均质糖链偶联抗体在异种移植小鼠模型中显示出比异质赖氨酸偶联抗体更多的积累。
方案 8. 使用半乳糖基转移酶突变体的ADC制备方法。括号内显示的是异质性组分。
方案 9. 使用半乳糖基转移酶突变体的替代ADC制备方法。括号内显示的是异质性组分。4.总结与展望
在这里，我们总结了抗体糖基工程技术和开发均质ADC制剂的方法。由于对ADC和抗体药物的需求持续增加，了解糖链功能至关重要。尽管已经报道了不同的均质ADC制备方法，但本文报道的化学-酶法途径具有许多优势。由于N-糖链位于Fc区域，有效载荷的偶联不会干扰抗原结合。此外，糖链原本就存在于Fc区域，因此引入的突变或外来序列的免疫原性不是问题。
目前，许多ADC和治疗性抗体生产的商业制造过程使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。然而，这种系统的生产力仍然很低。因此，正在研究CHO细胞的替代品，如微生物蛋白生产系统、蚕和酵母。这些系统产生的抗体带有高甘露糖糖链。正在探索通过糖基重构技术将高甘露糖型糖链转变为人类型复杂型糖链，以降低抗体生产成本的尝试。
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