承接上期我们介绍了在研究蛋白与DNA互作的注意事项（国自然申请|研究“蛋白与靶基因DNA互作”的几种经典技术（上））后，我们把研究方法汇总一下。如前所述，在研究蛋白与DNA互作的方法中，大致有两个角度：确定蛋白与DNA结合，以及确定转录调控作用两个。
染色质免疫沉淀测序（Chromatin
Immunoprecipitation, ChIP））是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的高通量测序技术。它可以用来识别特定蛋白质（通常是转录因子或组蛋白修饰）在基因组上的结合位点。
大致步骤：
1）免疫沉淀：首先，细胞被固定，通常是通过甲醛交联，这样可以保持蛋白质和DNA之间的相互作用。然后，使用针对特定蛋白质的抗体进行免疫沉淀，将目标蛋白质及其结合的DNA一起沉淀下来。
2）DNA片段化：交联被逆转后，DNA被酶切或物理方法打断成小片段，以便进行测序。
3）测序（Sequencing）：沉淀下来的DNA片段被纯化并进行测序。这可以是短读长测序也可以是长读长测序，取决于实验设计和使用的平台。
4）数据分析：测序得到的短序列（reads）被比对到参考基因组上，以确定蛋白质结合的精确位置。通过分析reads的分布，可以识别出富集的区域，即蛋白质结合的位点。
说明：ChIP-Seq是大家最为熟悉的筛选与蛋白结合DNA序列的组学方法，而ChIP后进行PCR则是直接的验证方法。在国自然项目或者大家研究中，主要用于筛选转录因子蛋白的靶基因，是技术必选项了。当然，ChIP-Seq/PCR也有一些注意事项：比如a）ChIP-Seq类似于RIP-Seq，也是没法精确到具体结合位点的（理论上说蛋白与DNA结合也只是一个位点）；b）实验分组的设置，一般情况下除了ChIP组以外，还需要Input和IgG组；c）通过PCR验证ChIP-Seq结果时，也需要设计多对引物：在结合峰位置设计2-3对引物，而非结合峰位置也需要设计引物，从而进一步确认结合峰的位置。
二、DNA pull-down实验
DNA pull-down实验基于蛋白质与特定DNA序列之间的亲和性，通过特定的DNA探针捕获与其结合的蛋白质，实现对蛋白质-DNA复合物的富集和分析。
大致实验步骤：
1）DNA探针制备：首先合成或制备含有目标DNA序列的探针，这些探针可以是寡核苷酸或DNA片段，并通过化学合成或PCR扩增等方法获得。
2）DNA探针修饰：在DNA探针的末端引入标记物，如生物素或荧光染料，以便实验操作和检测。
3）蛋白质提取：从细胞或组织中提取目标蛋白质样品，这可以是细胞裂解物、组织提取物或纯化的蛋白质。
4）DNA探针固定：将修饰后的DNA探针固定在固相载体上，常用的载体包括琼脂糖珠或磁珠。
5）DNA-蛋白质结合：将蛋白质样品与固定的DNA探针混合孵育，使蛋白质与DNA探针发生特异性结合。
6）洗涤：通过多次洗涤去除未结合的蛋白质，以减少非特异性结合，提高实验的特异性和准确性。
7）蛋白质检测与分析：使用Western blot、质谱分析等方法对与DNA探针结合的蛋白质进行检测和分析，以鉴定特定的蛋白质-DNA相互作用。
说明：DNA pull-down实验与ChIP-Seq实验是“镜像”实验，关系类似于RNA pulldown和RIP-Seq的关系，因此DNA pulldown是通过DNA探针来找（筛选）蛋白的。所以大家如果知道了靶基因，想通过实验方法筛选可能调控靶基因转录的蛋白，就可以通过这个方法筛选。同样的道理，在DNA pulldown实验中也需要设计对照组，以排除非特异性结合；当然也可以通过蛋白条带来比较各组的差异，并对特异性条带通过质谱鉴定或者WB验证。
三、DNA EMSA实验
DNA EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，电泳迁移率变动分析）实验是一种用于研究蛋白质与DNA之间相互作用的技术。EMSA基于DNA-蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中的不同迁移率。当转录因子与特定的DNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。
大致步骤：
1）设计特异性探针：根据研究目的设计特异性探针实验组以及非特异性对照组。
2）混合孵育：将设计好的探针与样本蛋白混合孵育，形成蛋白-探针复合物。
3）聚丙烯酰胺凝胶电泳：进行电泳，并将蛋白-探针复合物转移到膜上。
4）检测与成像：在膜上检测、曝光成像，观察蛋白-探针复合物的位置，从而判断是否有蛋白与目标探针有互作。
说明：DNA EMSA实验也是验证DNA与蛋白结合的经典方法，先前我们说验证蛋白与RNA结合的时候说过RNA EMSA，也就是说不管是DNA还是RNA，都可以通过EMSA实验进行验证。虽然这个技术在很多国自然本子里面不出现，但确实是很简单、但很重要的证明蛋白与DNA结合的直接技术，像ChIP-Seq和DNA pulldown是不能直接证明结合的；而且这个技术如果用好了，还能证明B蛋白在A转录因子结合靶基因DNA的必要桥梁作用。
四、（双）荧光素酶报告基因实验
荧光素酶报告基因实验是研究转录因子对靶基因DNA转录调控活性的经典实验之一。荧光素酶报告基因实验利用荧光素酶基因作为报告基因，通过测量其活性来反映转录因子与靶基因启动子区域的相互作用。
大致步骤：
1）构建报告基因载体：将含有靶基因启动子序列的DNA片段插入到荧光素酶基因的上游，构建报告基因质粒。
2）转染细胞：将报告基因质粒和转录因子表达质粒共转染入目标细胞中。
3）刺激处理：根据实验需要，对转染后的细胞进行特定的刺激或处理。
4）荧光素酶活性测定：在刺激处理后，向细胞中添加荧光素酶底物，检测荧光素酶活性。
5）数据分析：通过比较荧光素酶活性的变化，分析转录因子对靶基因DNA结合的影响。
说明：荧光素酶报告基因实验应用场景很多，可以用来验证转录因子调控靶基因转录活性，也可以用在很多其它的场景中，比如miRNA对靶基因mRNA的调控等；而且一般做的是双荧光素酶报告基因（做背景校正）。还有一点很重要的：在研究靶基因转录活性上，荧光素酶报告基因本质是转录活性的增加，而并不局限在转录因子对靶基因的作用上，举个相对极端一些的例子：比如我们可以通过荧光素酶报告基因实验发现miRNA-1能增加基因A的转录活性（这里不是miRNA与靶基因的荧光素酶，而是启动子的荧光素酶），其实就可以说miRNA-1转录激活基因A的，至于是不是直接转录激活，即miRNA-1作为NamiRNA转录激活基因A，还是miRNA-1通过经典方式抑制（直接）靶基因T（mRNA降解或者mRNA翻译抑制）从而导致靶基因T转录激活基因A，就是后续要验证的具体机制了。
总结：本期总结的4个技术都是非常经典和常见的技术，稍微新一些的Cut-tag这些技术都没有说，就个人观点来说：技术是为了解决科学问题，只有对某个技术的优劣势很了解，才能对技术呈现的结果有很好的解读，就像WB这样简单的技术，不同人跑出来的条带差别还是很大；另外，当我们想解决某个科学问题但是没有很好的技术方法时，就可以基于对技术的了解，改造和开发新技术。
最后预告一下本周六直播主题：“介绍一下我们团队，并进行国自然或者科研答疑”。
