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全流程PCR分子POCT,仅需25分钟!

小桔灯网  · 公众号  ·  · 2025-01-24 18:56

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背景介绍

新冠疫情以来,核酸POCT一直是分子诊断领域的研究热点,国内外研发团队和企业密集推出了非常多优秀的设计和方案,如Cue Health,在一次性卡盒中整合了样品处理、核酸扩增和结果输出功能。

高质量的核酸提取是核酸扩增实验成功的关键环节。 样品中的血红蛋白、黏蛋白、脂类以及采样过程中引入的无机盐、核酸酶甚至灰尘等物质会干扰扩增实验。 此外,出于生物安全的考虑,病毒采样管会使用胍盐、醇类等化学物质对病毒进行灭活处理,这些物质会严重抑制扩增实验。

因此,在核酸POCT中包含核酸纯化就成为众多方案的首选,如老牌企业罗氏诊断的cobas ® Liat ® 系统和赛沛(Cepheid)GeneXpert ® 也都具备核酸纯化的步骤。

如何在一个封闭的环境中完成病毒裂解、核酸吸附、清洗杂质、核酸洗脱、反应体系配置、扩增和信号检测等步骤,同时兼顾成本和效率便成为了核酸POCT设计的难点。 实现以上功能的核心是在一个封闭的卡盒内进行不同液体的驱动和切换。

中国CDC病毒病所核酸POCT技术介绍

中国CDC病毒病所提出了一种简单的设计,其核心结构是一个环形排列的溶液仓构成的外壳和被溶液仓环绕的偏心注射器,通过偏心注射器在外壳内的旋转和穿刺,实现了“样品进、结果出”全流程核酸检测功能。

图1:一次性卡盒外形

核酸提取和扩增一体化系统由一体化卡盒和设备共同组成,其中一体化卡盒包含 核酸提取和扩增的所有元件和试剂,它由内至外分别为注射器、弹簧、限位卡套、卡盒主体,以及连接在卡盒主体下部的PCR管。

图2:一次性卡盒示意图

由活塞和偏心注射器(装有可吸附核酸的硅胶膜)组成的注射器可以在卡盒主体中旋转,注射器旋转时偏心注射器底部的针头的运动轨迹是一个圆形,在对应的卡盒主体上有6个等距离分布的开口(上方用硅胶塞进行密封),分别与6个微管道相连,其中5个管道通向卡盒主体上的溶液管,1个管道通向卡盒主体下方的PCR管。

通过注射器和卡盒主体的相对旋转,将针头对准不同的开口,通过注射器的下压或提升,实现注射器与不同溶液管或PCR管的连接; 通过活塞的上下运动,实现溶液的吸排。 通过以上动作的组合实现核酸的纯化和扩增反应体系配置。

卡盒的1-5号管中分别预先装好样本裂解液、清洗缓冲液1、清洗缓冲液2、核酸洗脱 缓冲液和核酸扩增反应混合物。

把待测样本加入1号管后,将卡盒装入设备。 通过旋转卡盒,以及注射器活塞上下运动,完成 核酸纯化,扩增,和荧光信号检测。

一次性卡盒整体结构简单,不使用芯片等需要精密加工条件的材料,加工成本不超过5元; 与之配套的仪器由三个步进电机完成卡盒的旋转和注射器的穿刺以及活塞上下推拉运动。 系统具备四荧光通道,支持变温荧光PCR和恒温扩增。

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