这篇review带你了解，人类线粒体转录的机制与调控

Basic Information

• 英文标题：Mechanisms and regulation of human mitochondrial transcription
• 中文标题：人类线粒体转录的机制与调控
• 发表日期：02 October 2023
• 文章类型：Review Article
• 所属期刊：Nature Reviews Molecular Cell Biology
• 文章作者：Benedict G. Tan | Maria Falkenberg
• 文章链接：https://www.nature.com/articles/s41580-023-00661-4

Abstract

Para_01

1. 线粒体基因的表达会根据不同细胞类型的代谢需求进行调节，但这一过程的基本机制仍不清楚。
2. 在这篇综述中，我们描述了不同层次的调节如何协作，以精确调控人类细胞中线粒体DNA（mtDNA）的转录和复制的启动。
3. 我们讨论了目前对驱动和调节mtDNA启动子转录启动的分子机制的理解，以及mtDNA包装成核小体如何控制可用于转录和复制的mtDNA分子数量。
4. 事实上，线粒体转录机制的一个独特方面是它与mtDNA复制相耦合，以至于线粒体RNA聚合酶除了需要合成mtDNA复制起始点的引物。
5. 我们讨论了在主要复制起点（OriH）控制复制引物形成和基因组长度RNA合成之间选择的方式，以及最近在人类中发现的一个额外的线粒体启动子（LSP2）可能改变这一长期模型。

Introduction

Para_01

1. 哺乳动物细胞的线粒体网络通常包含数百至数千份环状、双链DNA基因组
2. 线粒体DNA（mtDNA）的两条链，分别称为重链（H）和轻链（L），由于它们的浮力密度不同，编码了37个无内含子的基因，这些基因共同负责线粒体内特定的翻译，生成氧化磷酸化（OXPHOS）机制中13个独特且必需的蛋白质组分

Fig. 1: Organization of the human mitochondrial genome.

• 人类线粒体DNA（mtDNA）的示意图。顶部展示了一个mtDNA非编码区（NCR）的放大版本，以强调其各种非编码元素。轻链转录本（红色外箭头，源自轻链启动子（LSP）或LSP2）在16S rRNA基因下游终止，而重链转录本（红色内箭头，源自重链启动子（HSP））在NCR的3'端终止相关序列（TAS）处终止。COX，细胞色素c氧化酶亚基；CSB，保守序列块；CYTB，细胞色素b；ND，NADH脱氢酶亚基；OriH，重链复制的起点；OriL，轻链复制的起点；rRNA，核糖体RNA。

Para_02

1. 人类的线粒体无法被转染，这阻止了在活细胞中对线粒体DNA中的调控元件进行功能性的反向遗传学研究，尽管最近发展的线粒体碱基编辑技术有潜力克服这一局限。
2. 因此，线粒体DNA元件的功能性角色在很大程度上是通过体外实验，即在无细胞实验中研究的。
3. 基于这项工作，确定了启动线粒体DNA复制和转录所需的所有调控遗传元件都包含在一个单独的基因间非编码区域（NCR）中，该区域包含链特异性的启动子、三个保守序列块（CSB1、CSB2和CSB3）、与终止相关的序列（TAS；与转录和复制的终止相关）以及H链复制的起源（OriH）——这是线粒体DNA合成的起始位点（图1）。

Para_03

1. 线粒体转录是由单一亚基的线粒体RNA聚合酶（POLRMT）执行的，它与T7噬菌体RNA聚合酶（T7 RNAP）有关。
2. POLRMT直接与启动子元素相互作用，但需要线粒体转录因子A（TFAM）和线粒体转录因子B2（TFB2M）来启动转录。
3. 在哺乳动物中，每条链都有一个启动子——L链启动子（LSP）和H链启动子（HSP）——从NCR规范地启动转录。
4. 正如我们后面将要讨论的，最近又发现了一个第三个启动子（LSP2）。
5. 最近的一项研究表明，果蝇melanogaster的POLRMT含有3′-至5′的外切核酸酶活性，但这一观察在人类中的功能相关性仍有待确定。

Para_04

1. 线粒体转录产生多顺反子转录本，这些转录本经过核苷酸切割处理生成mRNA、tRNA和核糖体RNA（rRNA）。
2. 大多数线粒体mRNA和rRNA基因被tRNA基因所包围，通过内切酶RNase P和ELAC2切割去除tRNA，释放出这些mRNA和rRNA分子。
3. 然而，在某些‘非规范’位置（例如，ATP6/8基因和COX3基因之间），mRNA不是由tRNA间断的。
4. 目前尚不清楚这些位点上的转录本处理是如何进行的，但有两种蛋白质，FAST激酶结构域包含蛋白4（FASTKD4）和FASTKD5，与这一活性有关。
5. 此外，最近的研究表明，在某些FASTKD蛋白质在线虫D. melanogaster的非规范处理中是必需的，并且它们的活性导致形成3'磷酸酯，随后被一种特殊的磷酸酶水解。
6. 但是，非规范处理的精确步骤仍有待确定，可能需要通过体外重组该过程来实现。

Para_05

1. 转录在线粒体基因组的定义区域内终止，该区域位于所有链特异性编码元素下游的短距离处。
2. L链转录本的终止由线粒体转录终止因子1（MTERF1）促进，该因子作为一种方向特异性（‘极性’）路障，同时阻碍转录和DNA复制，其作用方式类似于细菌蛋白Tus，而H链的转录终止发生在NCR内的TAS区域，通过尚不明确的机制进行。

Para_06

1. 核基因通常只存在一个或两个副本，真核细胞已经发展出复杂的强效基因激活过程，可以从基因启动子增强转录的频率数千倍。
2. 相比之下，线粒体DNA的拷贝数明显更高，这表明线粒体基因表达频率的调节并非主要在个体启动子的起始水平上进行，而是通过调节可用于转录的线粒体DNA分子的比例来实现。
3. 同样的原理也适用于线粒体DNA复制的调节，一部分线粒体DNA分子可用于复制，而其他的则保持紧凑的‘沉默’状态。

Para_07

1. 各种转录后过程在活细胞中调节不同线粒体基因转录本的水平，而线粒体蛋白合成在细胞类型间的变异性主要是由于mRNA的周转率不同，而不是mRNA的产生。
2. 相比之下，很少有因素被证明可以调节线粒体转录的启动，特别是在人类中。
3. 然而，近期的几项发现更新了我们对此过程长达数十年的理解。
4. 在这篇综述中，我们讨论了人类线粒体转录启动的机制和调控方面的当前理解，以及其与mtDNA复制的联系。
5. 此外，我们还讨论了可用于活跃转录和复制的mtDNA分子的数量似乎是一个重要的线粒体功能调节器，以及这一特性如何为治疗与mtDNA突变相关疾病的患者开辟可能的新途径。
6. 值得注意的是，还有大量文献关于核因子直接调节线粒体转录的可能性，其重要性最近已被其他地方所综述。
7. 这些发现并未在线粒体基因转录领域获得关注，部分原因是难以区分这些转录因子在线粒体中的直接作用与其在核基因表达中的间接作用。
8. 此外，大多数所谓的核因子并未在MitoCarta的基质蛋白组中发现，MitoCarta是一个高置信度的线粒体蛋白质组图谱，被认为是该领域的黄金标准。

Mitochondrial promoters and their regulation

Para_01

1. 转录起始位点（TSSs）是根据其生成新生转录物的能力来绘制的，这些新生转录物具有独特的5′-三磷酸化末端（这是转录过程中第一个核苷三磷酸被整合的特征），可以通过体外使用牛痘病毒加帽酶的鸟苷酰转移酶活性来选择性标记。
2. 在20世纪80年代初，这种体外加帽方法被用于从人细胞中分离出的线粒体转录物，以确定规范线粒体启动子HSP和LSP在NCR内的位置。
3. 不久之后，高分辨率的S1核酸酶绘图使能够识别从体外合成的线粒体转录物中的精确TSSs和LSP与HSP的最小启动子序列，这些转录物是使用系统性地截短的NCR片段和含有RNA聚合酶活性的线粒体提取物生成的。
4. 这种细胞自由的体外系统最终被纯化的重组蛋白和DNA模板的使用所取代，以确定LSP和HSP转录激活的前提条件，以及最近重新分配这些启动子的TSSs。
5. 第二个重链启动子（'HSP2'）之前已被其他小组提出，但其作为一个真正的线粒体启动子的身份，在相互冲突的证据面前受到了强烈的质疑。
6. 在本节中，我们将讨论POLRMT的启动子特异性转录机制，以及人体线粒体启动子的转录活性如何在活细胞中被调控。

Fig. 2: Mitochondrial promoter recognition and initiation of transcription.

• 图a展示了线粒体启动子示意图（显示的是非模板链序列）。历史上的转录起始位点（TSS）和新的注释的TSS被标出。图b-d，转录起始复合体的组装，由核心的人类线粒体转录蛋白线粒体RNA聚合酶（POLRMT）、线粒体转录因子A（TFAM）和线粒体转录因子B2（TFB2M）完成。图e，进程性延伸复合体，其中POLRMT与转录延伸因子，线粒体（TEFM）相关联。HSP，重链启动子；LSP，轻链启动子。

Core characteristics of human mitochondrial promoters

人类线粒体启动子的核心特征

Para_01

1. 人类的线粒体启动子至少包含一个大约50个碱基的区域，其中包含一个特定的TFAM结合位点，定位在TSS上游约15-40个碱基的位置（图2a）。
2. 历史上，这个TSS曾被定位在一个保守的富含腺嘌呤的基序（5′-AAAGA-3′）的第一个核苷酸上，但最近的研究表明，TSS实际上是基序中第二个腺嘌呤（5′-AAAGA-3′）。

Para_02

1. 一系列的结构、生物化学以及体内小鼠遗传学实验已经证实，典型的人线粒体启动子LSP和HSP需要POLRMT和两个转录因子TFAM和TFB2M来激活。
2. 尽管LSP和HSP之间的序列保守性非常低，但这三个核心转录蛋白在两个启动子的功能保守区域以相同的方式组装，以启动转录。
3. 生物化学研究工作表明，这些因子的组装是顺序进行的，首先是TFAM结合到其同源位点，即TSS上游的位置，这会在DNA上引起U形弯曲，并通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用促进POLRMT招募到TSS。
4. 之后，TFB2M与这个组装结合，完成启动复合体的形成，并且其与TSS的相互作用引起明显的结构变化，解开启动子DNA，以形成第一个磷酸二酯键。
5. POLRMT和TFB2M都参与了启动子元件的序列特异性识别，在启动子初步解链后，TFB2M与TSS附近的核苷酸形成相互作用。
6. 然而，动力学研究提出了另一种观点，即核心转录蛋白独立地与启动子结合，POLRMT和TFB2M可以在启动子上形成一个高亲和力但不稳定的转录复合物，尽管在这种模型中仍然需要TFAM来启动转录。
7. 我们更倾向于第一种，即顺序模型，部分原因是由于在LSP、HSP以及新发现的LSP2上没有观察到稳定的POLRMT-TFB2M复合物的明显足迹。
8. 尽管模型之间存在差异，但值得注意的是，两者都反对线粒体转录仅由POLRMT和TFB2M组成的两成分系统，正如之前所提出的。

Para_03

1. 在转录延伸过程中，TFAM和TFB2M被释放，转录延伸因子线粒体(TEFM)与POLRMT的活性位点以及模板链和下游DNA广泛结合。这些相互作用稳定了延伸复合物，并允许‘连续性’的，基因组长度范围的RNA合成。
2. 与TEFM进行连续延伸的需求一致，小鼠中Tefm的缺失导致远离启动子的线粒体转录本显著减少。有趣的是，在这种情况下，还观察到未处理转录本的积累，这表明转录延伸和RNA加工是相互联系的过程。
3. 线粒体转录过程的结构细节（即起始、延伸和终止）在其他文献中有更详细的讨论，以及与其他生物体中这些核心成分的显著差异。

Two light-strand promoters

两个光链启动子

Para_01

1. 近期，我们报道了在人类线粒体基因组上发现的第二个轻链启动子（LSP2）。
2. 尽管LSP和HSP在NCR的5'端彼此位置接近，但LSP2位于NCR的3'端，紧邻第一个L链基因（tRNAPro）之前，并且与LSP和HSP具有完全相同的核心分子特性（见图1和图2）。
3. 重要的是，利用一种深度测序的鸟苷酰转移酶加帽方法（Cappable-seq）确认了LSP2在人类细胞中的活性，并且这与人类细胞中转录起始的独立的全基因组分析结果一致。
4. 然而，无论是在无细胞体系还是人类细胞中，LSP2的活性似乎都明显弱于LSP和HSP，这部分是由于其在序列上的细微差异在群体水平上被青睐，因为能够在体外显著增加LSP2活性的突变（在LSP和HSP中未发现此效应）在人类群体的线粒体基因组中是不存在的。
5. 尽管其活性降低，LSP2确实在体内支持转录起始，因为在培养的人类细胞中引入LSP2的转录刺激点突变（通过线粒体基因组编辑）会导致由L链特异编码的tRNA的稳态水平增加。
6. LSP2的基因位置，与LSP和HSP分开，以及其低活性也很可能解释了为什么它直到最近才被检测到（详见框2）。

Para_02

1. LSP2 在体外也可以被 DNA 的负超螺旋独特地刺激，这在以前并没有发现会显著影响 LSP 和 HSP 的相对转录活性。
2. 尽管这种效应在活细胞中的确切程度尚不清楚，但已经记录下核基因组和细菌基因组中的启动子具有类似的‘超螺旋敏感性’机制，并且这可以作为在体内独立调节 LSP2 活性的手段。
3. 因此，LSP2 的活性可能与拓扑结构改变 mtDNA 的过程固有地耦合，例如来自 TFAM 诱导的 mtDNA 缩合的负超螺旋、转座 RNA 聚合酶产生的拓扑结构变化、DNA 复制叉前面的正超螺旋以及线粒体拓扑异构酶的活性。
4. 然而，mtDNA 的各种拓扑结构变化如何影响 LSP2 活性但不影响 LSP 和 HSP 活性，特别是在活细胞中，这是一个复杂的问题，尚未得到解答。
5. 最后，值得注意的是，尽管负超螺旋也被提出可以选择性地激活来自 HSP2 的转录（参考文献 74），但 HSP2 的分子特征与真正的线粒体启动子不一致。

Para_03

1. 尽管有证据支持LSP2在体内的活性，但其生理功能尚不清楚。
2. 例如，由于LSP和LSP2在同一方向上启动转录，因此在活细胞中这两个启动子的转录可能必须协调进行，这可能证明研究起来具有挑战性，因为来自LSP2的处理过的转录本（缺乏5'三磷酸，这标志着新生成的线粒体转录本能被鸟苷酰转移酶加帽识别10,32,66）与来自LSP的处理过的转录本无法区分，这突显了需要开发能够明确检测LSP2活性的方法。
3. 此外，人们忍不住猜测LSP2在人类细胞中的低活性可能会对不同细胞线索或不同细胞类型的代谢需求（例如，分裂细胞与终末分化细胞）作出反应——LSP2是否以及如何受到调控是重要的未解之谜。
4. 尽管如此，LSP2作为人类细胞中功能性、活性启动子的发现，突显了我们对人类线粒体基因组的理解有限，尽管其全长序列确定已有近半个世纪2，并促使重新评估现有的线粒体基因表达模式模型。
5. LSP2的活性对于L链基因表达也具有一个重要的相关性，我们将在后面讨论。

Differential activation of mitochondrial promoters

线粒体启动子的差异激活

Para_01

1. TFAM 是第一个与线粒体启动子结合的因子，并且它招募 POLRMT 的能力类似于在其他系统中需要刺激转录的基因特异性因子的功能。
2. 例如，细菌中启动子特异性的转录起始由 sigma 因子的结合来指导，而在真核生物中，则是由多个基础转录因子和基因特异性激活蛋白的协同组装来指导。
3. 相比之下，不同的线粒体启动子需要相同的蛋白质进行起始，并且没有因素被显示出来优先激活或抑制来自 LSP 或 HSP 的转录。

Para_02

1. 除了在转录启动中的作用外，TFAM 还是一种线粒体DNA（mtDNA）包装因子，负责将mtDNA紧致成称为核体的结构，使得TFAM在mtDNA上的占有率与mtDNA的紧致程度增加和mtDNA事务的减少相关（后文将讨论）。与这一功能相符，有研究表明TFAM浓度可能控制不同mtDNA启动子在体内的相对活性，因为多项工作显示LSP和HSP在体外具有不同的最佳TFAM浓度。LSP活性在较低的TFAM浓度下被刺激，并且与HSP相比，在更广泛的浓度范围内保持活性。相比之下，来自HSP的转录需要更高的TFAM浓度才能启动。然而，我们认为这些观察结果应该谨慎解读，因为即使在相对较高的TFAM浓度下，这两者启动子在体外的活性仍然很强大，这与估计的体内比例相一致，即每约15-18 bp的mtDNA对应一个TFAM。此外，尚缺乏证据表明TFAM水平的细微变化确实会在体内不同地影响启动子活性。尽管在人类线粒体中已经显示链特异性转录本‘丰富度’会有所变化，但这不一定等同于启动子‘强度’的差异；实际上，链特异性转录本丰富度已被证明是不同转录本处理的结果。此外，结构和生物化学研究已经确定LSP和HSP具有相同的TFAM组装和取向，这反驳了之前提出的假设，即不同的TFAM结合模式在HSP导致不同的激活。需要注意的是，mtDNA的两条链都编码了必需的基因，并且任意链上基因的转录减少都可能导致正确翻译所需的tRNA池失衡。因此，在线粒体网络中总是需要两条链的转录（图1）。

ATP sensing by mitochondrial RNA polymerases

线粒体RNA聚合酶对ATP的感应

Para_01

1. 在几乎所有的真核生物中，细胞内的大部分ATP是通过线粒体呼吸作用通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生的，这提高了线粒体基质内的ATP水平。
2. 然而，尤其是在哺乳动物中，目前尚不清楚线粒体是如何协调基因表达以适应组织特定的ATP需求。
3. 在酵母细胞中的研究已经证明，编码关键的OXPHOS蛋白的线粒体转录本水平的变化与各个启动子对ATP浓度的敏感性有关。
4. 在某种程度上，这一观察结果得到了在分离的人体线粒体上进行的研究的支持，并导致了这样一个假设：线粒体RNA聚合酶可能直接‘感知’基质ATP水平，从而有效地协调转录以匹配细胞的呼吸能力。
5. 这一假设表明，增加线粒体ATP合成可能潜在地加强增加的OXPHOS，反之亦然。
6. 事实上，酵母线粒体RNA聚合酶在启动子处需要更高浓度的前两个启动的核苷酸三磷酸（其中第一个是ATP）以达到最佳活性，并且改变模板DNA上的这些核苷酸可以改变核苷酸利用的动力学。

Para_02

1. 线粒体RNA种类不断地受到核酶降解，这会产生二核苷酸，包括5'单磷酸二腺苷（pApA）种类，其磷酸二酯键是通过转录预先形成的。
2. 这些可以作为转录的引物，因为pApA的序列和化学结构与在转录从线粒体TSSs（例如，5'-AAAGA-3'）开始的第一个磷酸二酯键形成的相似。
3. 因此，为了ATP感应模型在人类线粒体中起作用，pApA必须有效地被降解，这样它们就不会引物转录并绕过ATP感应机制。
4. 人类线粒体中的二核苷酸降解是由专门的核酸酶，RNA外切酶2（REXO2）促进的，其缺失会增加线粒体二核苷酸水平并导致异常的转录起始，无论是在线粒体启动子还是线粒体DNA中的其他非特异性序列元素，在体外和体内都是如此。
5. 因此，REXO2有效地进行二核苷酸转换是维持调节性、启动子特异性的转录所必需的，这为ATP感应假设提供了间接的支持。

Para_03

1. 需要注意的是，即使ATP被用作人类线粒体转录的引物核苷酸，也不一定意味着ATP感应是一个进化上保守的过程——这可能只是对线粒体基质中ATP丰富环境的适应。
2. 实际上，即使以GTP开始的线粒体启动子很少见，但在其他哺乳动物（例如，啮齿类动物）中已经发现了它们。
3. 此外，GTP在许多物种中经常被用作第二个核苷酸，包括猫和狗的LSP。
4. 这些观察使我们质疑ATP感应机制在哺乳动物细胞中的生理相关性。

Transcription-coupled mtDNA synthesis regulates L-strand transcription

Para_01

1. 与转录一样，线粒体DNA复制是由一种专门的酶机制执行的，这种机制与核机制不同。
2. 这个机制的核心是DNA聚合酶-γ（POLγ），它与DNA解旋酶Twinkle和线粒体单链DNA结合蛋白（mtSSB，也称为SSBP1）协同作用，在 mitochondrial 复制叉形成一个最小的复制体。
3. 在核、细菌和噬菌体系统中，经典复制体通常需要一个专用的引物酶来合成短的RNA引物以启动DNA复制。
4. 然而，哺乳动物线粒体缺乏这种酶，相反，POLRMT在两个位置为mtDNA复制提供RNA引物，这两个位置分别是用于H链DNA合成（OriH）的复制原点和远端的用于L链合成的复制原点（OriL）。
5. POLRMT作为线粒体引物酶的这一角色得到了小鼠模型的支持，该模型显示，在小鼠心脏中条件性敲除Polrmt会严重减少mtDNA的合成。
6. 这两个原点中，POLRMT首先激活的是OriH，这个区域是根据NCR中的RNA到DNA转换位点来确定的，这里是POLγ从RNA引物的3'端启动mtDNA合成的地方。
7. 这种引物被认为来自LSP介导的转录，因为LSP是唯一能够在OriH的H链DNA合成上游生成与H链DNA合成方向相同的RNA转录本的位置。
8. OriL是通过涉及茎-环结构的独立机制激活的，POLRMT从这个结构合成短的RNA引物供POLγ使用。
9. 关于OriL的激活和mtDNA从OriL的复制已在其他地方进行了综述。
10. 在本节中，我们将讨论OriH处引物形成的现行模型，以及最近发现的LSP2可能如何改变这个模型。
11. 我们还将讨论一种失败的mtDNA复制产物（7S DNA），其功能尚不清楚。

Transcription from LSP generates primers for mtDNA replication

LSP的转录生成线粒体DNA复制的引物

Para_01

1. 为了有效地作为OriH的复制引物，来自LSP的转录本必须满足两个重要要求：首先，它们必须与DNA模板杂交；其次，它们必须具有一个自由的3'端，可以被POLγ使用。
2. 在体外，相当一部分LSP转录本会在CSB2的同聚鸟嘌呤tract（G-tract）下游过早终止，留下一个持久的RNA-DNA杂合 duplex（R-loop），其中新生的RNA仍然与模板DNA链杂交。
3. 这种R-loop的显著稳定性归因于新生RNA转录自CSB2的鸟嘌呤与非模板DNA上其同源的富含鸟嘌呤序列之间形成的杂合鸟嘌呤四联体（G-quadruplex）。
4. 这种杂合G-quadruplex也被认为是使延伸的POLRMT复合体不稳定，并且其独特的结构被认为促进此区域的双链DNA分离并锚定新生的RNA到mtDNA。
5. 还有建议认为，mtSSB结合到R-loop的单链DNA区域，可以进一步稳定mtDNA链分离，有效地使R-loop结构专一性地投入到mtDNA复制中。
6. 这一效应可能解释了mtSSB在mtDNA合成起始中的基本角色——小鼠心脏中mtSSB的条件性丢失会废除mtDNA复制，但允许高水平L链基因的转录。

Fig. 3: H-strand mitochondrial DNA replication through RNA primer formation at origin of heavy-strand replication.

• H链复制的起始位置（OriH）的复制起始涉及线粒体RNA聚合酶（POLRMT）对富含G的保守序列块2（CSB2）的转录。
• 新生的RNA中的鸟嘌呤与非模板链CSB2中的鸟嘌呤形成了一种杂合RNA-DNA G四联体。
• 请注意，所展示的四联体结构是假设性的——其确切折叠（即DNA与RNA链之间的杂合）尚未确定。
• G四联体的形成导致POLRMT的转录终止，留下一个R环。
• R环通过线粒体单链DNA结合蛋白（mtSSB）进行稳定，并被RNase H1消化成短的RNA片段。
• R环对RNase H1的完全切割具有抗性。
• RNA片段被DNA聚合酶-γ（POLγ）用作引物，以启动H链的合成。
• 复制需要解旋酶Twinkle和mtSSB。
• 目前尚不清楚在这一步骤中G四联体是否持续存在。
• 请注意，OriH是指非编码区域（NCR）的一部分，其中包含指导线粒体DNA（mtDNA）合成的遗传元素，而不是通常注释的特定核苷酸位置。
• H链复制产物的命运。
• POLγ的mtDNA复制可以在NCR内过早终止，形成置换环（D-loop）。
• 这种失败的mtDNA产物被称为7S DNA（不要与7S RNA混淆）。
• 新生的DNA仍与mtDNA杂合。
• mtDNA复制在NCR之外的生产性进行。
• HSP，重链启动子；LSP，轻链启动子；OriL，L链复制的起始位置；TAS，终止相关序列。

Para_02

1. CSB2位置上的G-tract长度在不同组织类型和个体之间高度多态性，并且可以在体外调节转录终止的程度，这表明CSB2位置的转录终止频率具有组织特异性。
2. 一项研究也报告了CSB2区域存在线粒体DNA缺失，但这些序列变异如何影响线粒体DNA复制的启动尚未被研究。
3. 然而，需要注意的是，尽管在无细胞系统中OriH位置的R-loop稳定性已经有所报道，但在活细胞中鉴定这种结构一直很困难，这可能归因于其瞬态性质，因为R-loop的持久性可能导致基因组不稳定或LSP的转录较差的转换。
4. 关于OriH位置R-loop的形成也存在一些问题，因为即使体外实验表明新生RNA与非模板DNA链之间形成了一种杂合结构，但进行性POLRMT延伸复合物的结构表明新生RNA是远离上游DNA的。
5. 使用T7 RNA聚合酶作为替代聚合酶的交联和足迹研究已经提出了杂合G四链体可能的结构，但由于POLRMT在结构上与T7 RNA聚合酶不同，需要更多的工作来确认POLRMT是否形成类似的G四链体，以及正确定义OriH位置的R-loop的结构和形成。
6. 尽管如此，OriH位置线粒体DNA复制的人工重组已经在CSB3和CSB2区域映射了RNA到DNA的转换，这一发现得到了活细胞中CSB3位置POLRMT‘暂停位点’富集的支持，这可能表明引物加工和/或从POLRMT到POLγ的交接的发生。

Para_03

1. 由CSB2处的过早转录终止形成的自由RNA 3′-端不能立即被POLγ用于启动DNA复制，但必须首先被线粒体形式的RNase H1内切核酸酶处理（参考文献94）。
2. 类似于在细菌中的作用112,113，RNase H1有助于通过移除所有与mtDNA杂合的RNA来限制mtDNA合成的启动至OriH区域94,114,115（图3）。
3. 独特的是，可能是由于G-四链体结构的形成，CSB2处形成的R-loop对RNase H1切割具有部分抗性，并且剩余的RNA随后可以被POLγ作为引物使用94。
4. 在RNase H1缺失的情况下，体内的mtDNA合成反而可以从与DNA模板杂合的任何RNA分子启动。
5. 这可能导致mtDNA合成的启动在大范围的mtDNA上失调，正如具有杂合RNASEH1突变、破坏其催化活性的个体的原代细胞中所见94。

Para_04

1. 总之，从LSP的转录与H链线粒体DNA在OriH处的复制启动有关。
2. 有趣的是，OriH激活的某些方面与细菌和噬菌体的机制相似，这可能证明了线粒体起源于变形菌门。
3. 例如，在CSB2处的转录终止类似于噬菌体和细菌RNA聚合酶的无rho依赖性或内在转录终止，其中不是G四联体，而是新生RNA上的发夹结构的形成使转录的RNA聚合酶不稳定。
4. 在两种情况下，转录终止也受到RNA二级结构下游的聚尿嘧啶延伸合成的类似影响。
5. 此外，OriH处复制引物的生成方式（即涉及RNase H1介导的R-loop处理的转录偶联DNA合成）与细菌ColE1复制起源处DNA合成的引发非常相似，后者常见于许多传统的克隆质粒中。

Switching between transcription and mtDNA replication

在转录和线粒体DNA复制之间切换

Para_01

1. 在前面描述的OriH激活模型中，基因组长度转录和从LSP形成引物之间的选择是一个关键的调控机制，可能有助于控制复制启动的水平，并且有人提出，OriH上游的POLRMT活性转换调节这种平衡60（图4）。
2. 最初对线粒体转录延伸因子TEFM的生化研究注意到它能阻止POLRMT60,61,110依赖的CSB2转录终止。
3. 后来的结构研究表明，二聚体TEFM与POLRMT在其RNA出口通道附近结合，并将新生的RNA引导离开非模板DNA链，这被认为可以防止在CSB2形成杂合G四链体62。
4. 基于这些观察，有人提出TEFM可能是体内LSP转录命运的主要调控因子，通过控制基因组长度转录和复制引物形成之间的选择60。
5. 然而，对条件性Tefm基因敲除小鼠的心脏特征的研究对这一观点提出了质疑63。
6. Tefm的缺失导致LSP附近转录本的大量积累，这些转录本大多数在转录转变为复制的区域之前就终止了。
7. 因此，与‘开关’假说相反，新生的线粒体DNA复制被显著减少，这表明TEFM不可能是哺乳动物中OriH处引物形成调控因子。

Fig. 4: Mitochondrial transcription patterns and the potential role of the second light-strand promoter.

• 人类线粒体DNA（mtDNA）的简化示意图，展示了非编码区（NCR）的放大视图，指出了L链启动子（LSP）和H链启动子（HSP）转录物，以及H链复制起点（OriH）引物和7S RNA的位置。图中展示了LSP与LSP2之间的关系：LSP2的位置绕过了在OriH处的复制引物形成，从而使得L链基因可以在不考虑LSP的情况下独立合成。在OriL的激活过程中形成了茎环结构。CSB，保守序列块；F，tRNA-Phe基因；OriL，L链复制的起点；P，tRNA-Pro基因；TAS，终止相关序列。

Transcription from LSP2 can bypass L-strand transcription regulation at OriH

来自LSP2的转录可以绕过OriH上的L链转录调控

Para_01

1. LSP2（参考文献10）的存在和位置为之前讨论的现行模型提供了重要的更新，该模型在过去四十年中建立，其中复制引物形成和基因组长度转录之间的平衡完全由LSP的转录决定。
2. 由于LSP2位于所有L链基因的上游但位于OriH的下游（图1），因此，L链基因的整个表达谱可以独立于OriH的引物形成而表达。
3. 这种组织结构还意味着mtDNA的每条链都有独立生成复制引物（通过LSP生成OriH和从OriL内部生成）和基因转录物（通过HSP和LSP2）的不同位点的手段（图4）。
4. 但是，由于LSP2在人类细胞中的活性明显弱于LSP，因此这不排除LSP在H链mtDNA合成和L链基因转录中可能具有双重作用；LSP和LSP2活性之间的相互作用仍然是未来工作中需要解决的关键问题。

mtDNA replication frequently terminates at the 3′-end of the NCR

线粒体DNA复制经常在NCR的3'端终止

Para_01

1. 从转录到线粒体DNA合成启动的转换在哺乳动物细胞中是一个精心协调的事件，但与核中的情况相比，线粒体DNA复制启动似乎并不直接调节线粒体DNA的拷贝数。
2. 实际上，绝大多数在OriH启动的复制事件在大约650个核苷酸后的NCR内被提前终止，并且这个被称为7S DNA（不要与7S RNA混淆）的分子与线粒体DNA保持杂合状态，形成了一个三链位移环（D-loop）。
3. 也许正因为如此，'NCR'和'D-loop'这两个术语在文献中常常可以互换使用，但应该注意的是，这两个是彼此不同的。
4. 复制终止和7S DNA的形成发生在NCR的TAS区域，而从失败的7S DNA合成到基因组长度线粒体DNA复制的转换是一个受调控的事件，有助于控制线粒体DNA的水平。
5. 然而，早期复制终止（即7S DNA合成）的机制以及如何调控进展到全长线粒体DNA复制的长期未解决的问题一直是该领域的一个难题。
6. 一项研究报告了一个罕见的、可遗传的且非致病性的TAS区域缺失，这对其重要性提出了质疑，但缺乏对这些个体的线粒体DNA维持功能特征以及D-loop生物发生的基本了解，使得很难判断这一说法的有效性。

Auto-inhibition of POLRMT is regulated by the non-coding 7S RNA

Para_01

1. 除了复制引物和L链基因之外，从LSP的转录还产生了一个短、高丰度的、3'端多腺苷酸化的非编码转录本，由于其明显的沉降系数，这个转录本被称为‘7S RNA’。
2. 7S RNA的序列从LSP开始，并包含所有三个CSB序列，其3'端位于CSB1下游不远处（参考文献25,34）（图4）。
3. 由于其一级结构也含有CSB2，7S RNA常与在OriH处加工成复制引物的R-loop混淆（图3）。
4. 然而，与R-loop不同，在R-loop中新生RNA与线粒体DNA保持杂化，7S RNA不与OriH区域结合，而作为单链物种存在。
5. 早期对7S RNA的研究发现，它与其它L链转录本（即tRNAs和mRNAs）独立调节，并且其水平在应对生理挑战时显著变化。
6. 随后，发现7S RNA的水平与其他线粒体转录本的水平呈负相关，这一发现导致人们认为7S RNA可能调节线粒体基因表达。
7. 然而，直到最近，关于7S RNA功能的显著细节还很大程度上是未知的。

Para_02

1. 在最近的工作中，我们发现7S RNA具有一种以前被忽视的功能，即它是一种强大且高度特异的POLRMT活性抑制剂（图5）。
2. 在体外，添加7S RNA可以显著地以与POLRMT等摩尔水平抑制转录，这种效应主要归因于POLRMT与7S RNA中对应于CSB3的区域之间的相互作用。
3. 有趣的是，尽管CSB2的转录可以导致POLRMT的转录终止，但7S RNA中的CSB2区域对其抑制效应是可有可无的，这支持了7S RNA与依赖于CSB2的R-loop在OriH处形成的角色不同且不重叠的观点，尽管它们具有相似的基本结构元素。
4. 通过冷冻电子显微镜进行的结构分析揭示，7S RNA诱导形成POLRMT同源二聚体，其中每个单体上的催化和启动子结合域相互交互，阻止与转录因子（TFAM和TFB2M）和启动子DNA的相互作用（图5）。
5. 这一发现与7S RNA无法抑制POLRMT的过程性转录延伸的能力相一致，因为在延伸过程中，催化位点忙于与模板DNA和TEFM进行广泛的相互作用，从而阻止了与7S RNA的相互作用。
6. 因此，7S RNA选择性地通过阻止在启动子DNA上组装起始复合物来抑制线粒体转录的起始。

Fig. 5: 7S RNA inhibits mitochondrial transcription initiation.

• 从L链启动子（LSP）的转录产生了一种多腺苷酸化的转录本，其3'端位于保守序列块1（CSB1）的下游。
• 与复制引物不同，7S RNA不会保留与DNA模板的杂合状态，并且能够通过诱导线粒体RNA聚合酶（POLRMT）同二聚体的形成，从而在反式抑制线粒体转录。
• 二聚作用隔离了POLRMT的域，这对于启动子识别和解链是必需的。
• TFAM，线粒体转录因子A；TFB2M，线粒体转录因子B2；TEFM，转录延伸因子，线粒体。

Para_03

1. 无论是自由的还是与POLRMT结合的7S RNA，都可以被线粒体外切核酸酶复合物（mtEXO）在体外降解，该复合物由RNA解旋酶SUV3和外切酶PNPase（也称为PNPT1）组成。
2. 7S RNA被（mtEXO）降解可以恢复POLRMT的启动子结合，这表明可能存在一种体内转换的潜在机制。
3. 这些结构和生物化学结果与活细胞中的发现也相吻合，当7S RNA水平显著升高（通过SUV3耗竭）时，会降低线粒体从头转录。
4. 与7S RNA在转录起始中的角色一致，对SUV3耗竭的线粒体进行超分辨率显微镜观察发现，尽管大量的POLRMT与7S RNA共定位，但7S RNA并未与活跃的转录位点（通过5-溴尿嘧啶掺入检测）共定位。

Para_04

1. 总的来说，从LSP合成的7S RNA及其以剂量依赖性方式特异性抑制POLRMT活性的能力表明，7S RNA是一个负反馈环的一部分，它全局调控着来自所有启动子的线粒体转录。
2. 然而，7S RNA的生物发生和生理作用还是未知数。
3. 基于其3′端的定位，我们推测7S RNA是CSB1处活跃终止的结果；但是，使用POLRMT25并未在体外观察到像CSB2那样的实质性转录终止，这表明可能涉及到其他因素。
4. 值得注意的是，7S RNA抑制转录的机制似乎与其他系统中发现的机制不同，在其他系统中，抑制性非编码RNA会选择性地结合组装好的预起始复合物133，或者作为启动子DNA模拟物134,135。

TFAM regulates mtDNA transactions through nucleoid compaction

Para_01

1. 在活细胞中，线粒体基因组被组织成称为核体的DNA-蛋白质复合物——这个术语源自于在细菌中发现的类似结构。
2. 线粒体核体的主要蛋白质成分是TFAM，它不仅作为转录启动因子，还作为线粒体DNA包装因子。
3. 大多数核体只包含一个线粒体DNA分子，这个分子被TFAM完全覆盖。
4. TFAM的结构由两个DNA结合高活动组（HMG）盒域和一个C端尾组成。
5. TFAM能够结合到线粒体启动子的特定位点以及非特定位点以促进线粒体DNA的紧缩，这是具有串联HMG盒域的其他DNA结合蛋白质的共同特性。
6. 在本节中，我们将讨论TFAM促进线粒体DNA紧缩的机制，以及核体紧缩程度如何影响线粒体DNA的维持。

Compaction by TFAM

TFAM介导的压实

Para_01

1. TFAM介导的mtDNA紧密核的形成是通过局部DNA弯曲和长距离DNA桥接（即环状结构的形成）的组合实现的（图6a）。
2. 生物物理研究表明，TFAM可以协同地结合到DNA上，并且能在DNA上形成丝状结构，这有助于局部（短距离）的压缩。
3. TFAM诱导的DNA弯曲一直是解释这一效应的主要机制；然而，DNA弯曲的程度有些争议。
4. TFAM与线性DNA结合的晶体结构显示，TFAM单体可以急剧弯曲与启动子特异性的DNA以及非特异性的DNA 180°，这虽然逐步减小，但确实减少了结合DNA的端到端距离。
5. 这一发现表明，mtDNA上形成多个这样的U型转弯可以累积导致其压缩。
6. 然而，利用光学镊子的单分子研究指出，在拉伸的DNA底物上（这阻止了环状结构的形成），TFAM诱导的非特异性DNA弯曲不那么急剧，而是形成‘灵活’的DNA弯曲，尽管如此，仍会导致压缩。

Fig. 6: Nucleoprotein formation by mitochondrial transcription factor A and the regulation of mitochondrial DNA activity.

• 线粒体DNA（mtDNA）通过线粒体转录因子A（TFAM）的压缩机制。TFAM含有两个DNA结合，高活动组（HMG）盒域（HMG1和HMG2），它们通过两种机制来压缩mtDNA：通过弯曲和通过跨链结合形成环。两种机制都导致mtDNA的紧密压缩，使其凝聚成核体。
• 核体压缩状态与mtDNA活性的关系。为简单起见，只显示了线粒体RNA聚合酶（POLRMT）合成RNA，但这个过程还涉及DNA聚合酶-γ。完全压缩的核体阻止了转录和复制蛋白对mtDNA的访问，例如，对启动子（黑色弯曲箭头）的访问，就像POLRMT的情况那样。

Para_02

1. TFAM 也能促进 DNA 上的长距离、环状结构的桥接作用，尽管这一过程的机制尚存争议。
2. 生化实验表明，TFAM 在溶液中可以以单体或二聚体的形式存在，而有关 TFAM 同源二聚化的研究报道存在相互矛盾的结果。
3. 使用原子力显微镜的研究表明，TFAM 以二聚体的形式桥接 DNA 环。
4. 然而，对 TFAM 结合的线粒体 DNA 进行旋转阴影电子显微镜观察的实验结果对此提出了挑战。
5. 实验显示，TFAM 的卷曲-卷曲二聚化突变体仍然能够进行 DNA 的紧缩，这表明环状结构可能是由单个 TFAM 分子形成的。
6. 这种形成方式是通过‘跨链’DNA 桥接实现的，其中两个 HMG 盒域各自绑定在线粒体 DNA 上的不同且遥远的位点。
7. 然而，这种跨链结合模式为何会优先于局部形成弯曲尚不清楚。

TFAM is a regulator of mtDNA transactions and a potential therapeutic target

TFAM 是 mtDNA 事务的调节因子和潜在的治疗靶点

Para_01

1. 在体外，当TFAM与DNA的比例较高，能够致密地压缩线粒体DNA时，TFAM可以抑制线粒体DNA的转录和复制。
2. TFAM这种有条件地限制线粒体DNA事务的能力，被认为是通过线粒体核体的压缩状态（图6b）与这些过程的频率机理性联系起来的。
3. 超分辨率显微镜研究支持这一观点，表明在人类细胞中只有少数单独的核体参与活跃的复制和转录，并且这些活跃的核体看起来更大，可能是因为缺乏TFAM的DNA压缩。
4. 同一项研究还注意到，相反，不活跃的核体则以较高的TFAM与线粒体DNA比例为特征。
5. 对单独核体的高分辨率DNA可接触性分析提供了类似的结论，表明大多数核体存在于无法接近的不活跃状态。
6. 相比之下，可接触性高的核体与转录和复制因子相关，并含有D环。

Para_02

1. 目前尚不清楚是什么将核质重塑为活性状态以及是什么决定了活性核质与非活性核质之间的平衡。
2. 通过磷酸化释放与线粒体DNA结合的TFAM以及随后由线粒体基质蛋白酶LONP1对其进行降解，这一过程被认为有助于核质的重塑并调节线粒体DNA的维护，但负责在活细胞中磷酸化TFAM的激酶尚未确定，因此还需要更多的工作来验证所提出的模型。

Para_03

1. TFAM水平变化对小鼠模型的影响也已被研究146,147,148,149，其中TFAM的降低147或轻度过表达148,149似乎与mtDNA水平直接相关。小鼠Tfam的同型全身敲除导致mtDNA完全耗尽和严重的OXPHOS缺陷，导致胚胎致死；杂合子Tfam敲除小鼠是可行的，但mtDNA水平有所降低147。相比之下，小鼠组织中的TFAM轻度过表达导致mtDNA水平上调，但mtDNA表达和基础代谢保持不变149。这种耐受性被认为是因为线粒体DNA复制机制能够通过增加mtDNA合成来补偿，以维持有利于基因表达的TFAM:mtDNA比例。然而，在小鼠中更强更快地诱导TFAM似乎无法得到补偿，相反，会导致核质体通过紧缩而失活，进而导致mtDNA复制减少，线粒体功能逐渐下降，以及线粒体功能障碍表型的加剧149。因此，TFAM作为mtDNA事务的一般抑制因子发挥作用（图6b）。值得注意的是，除了TFAM，线粒体转录终止因子3（MTERF3）也被建议在活细胞中作为LSP和HSP活性的通用抑制因子，但其背后的机制尚未建立150。

Para_04

1. 有趣的是，线粒体DNA水平的增加也对病理状态有有益的影响。
2. 在哺乳动物细胞中，线粒体DNA突变可以存在于所有线粒体DNA副本中（同质突变），也可以只存在于部分副本中（异质突变）。
3. 大多数人类的线粒体DNA突变障碍是由功能上隐性的异质突变引起的，这些突变与野生型线粒体DNA的比例需要达到一定的阈值，才能使病理表型在受影响的个体中显现出来。
4. 在这种情况下，野生型线粒体DNA的不足水平也是导致疾病状态的原因。
5. 实际上，对小鼠的研究已经表明，通过提高TFAM水平来增加线粒体DNA副本数可以减轻线粒体DNA突变的致病效应，尽管突变型与野生型线粒体DNA的比例仍然很高。
6. 研究表明，这种修复效果是由于野生型线粒体DNA绝对水平的增加，这可能是以前被忽视的病理生理表型的决定因素，并且可以作为治疗线粒体DNA突变障碍的新策略。

Concluding remarks and future outlook

Para_01

1. 在这篇综述中，我们讨论了对线粒体基因转录最近的理解进展。
2. 我们强调了转录与线粒体DNA复制之间的联系，重点介绍了在OriH处引物形成的复杂机制。
3. 然而，正如之前讨论中提到的，仍有许多关键问题需要解决。

Para_02

1. 尽管对OriH处的引物形成有许多方面的理解，但是控制引物形成与全长度转录之间选择的机制尚未建立。
2. 在CSB2形成的G四链结构似乎在这一过程中起着关键作用，但这一证据主要来自体外研究，还需要更多的体内数据来验证所提出的模型。
3. 此外，线粒体转录机制如何响应代谢需求的变化仍然不清楚。
4. 在酵母中，ATP感应被提出作为一种机制，但如这里讨论的，ATP并不是在哺乳动物线粒体中普遍用作起始核苷酸，且该模型在人体细胞中的相关性尚未得到确证。
5. 相反，我们更倾向于认为，可供活跃转录和DNA复制的mtDNA分子数量是调节的关键手段，这一过程受TFAM介导的mtDNA包装进入致密核蛋白复合物控制。
6. TFAM水平如何根据代谢需求变化，以及是否存在特定的核仁重塑活动可以激活或沉默线粒体启动子，还有待研究。

Para_03

1. 非编码的7S RNA最近被发现可以通过促进POLRMT二聚体的形成来调节转录起始，从而导致引物合成和基因组长度转录的下调。
2. 7S RNA生物发生的许多方面，例如它是否以及如何在CSB1处终止，以及7S RNA水平的生理调节，仍有待确定，并且是正在进行的工作的主题。
3. 特别感兴趣的是确定可能调节与POLRMT相互作用的7S RNA结合蛋白，从而控制人类线粒体中可用于转录的POLRMT分子的含量。
4. 我们假设，在环境信号的刺激下，POLRMT从7S RNA中快速释放可能是刺激线粒体生物发生和活性的有效方式。

Para_04

1. 线粒体研究中一个持久的谜团是D环的功能重要性尚不清楚。
2. 多年来，关于其功能和生物发生的不同假设被提出，但没有任何一个被普遍接受。
3. 关于D环仍有许多问题存在，例如，新生第三链（即7S DNA）在活跃转录期间是否仍然与NCR相关联，还是被POLRMT取代。
4. 此外，目前尚不清楚7S DNA合成的终止是如何与TAS区域H链转录的终止协调的（因为这两个事件是收敛的），以及LSP2在此过程中扮演什么角色。
5. 也许，当稳定的D环阻止从规范的LSP进行基因组长度转录时，这个新的启动子被使用。
6. 这些和许多其他开放性问题仍有待解决。
7. 尽管在过去几年中，线粒体转录领域取得了巨大的进步，但我们才开始揭开这个复杂过程及其对人类生物学的许多谜团。