今天讲的这篇文章，是复旦大学基础医学院及浙江大学彭克松研究员，发表在14.6分的Autophagy上的文章。虽然杂志是自噬，但这篇文章其实讲的是脂肪酸的ROS氧化应激，棕榈酸的脂毒性，还挺有意思的：
来看这篇文章之前，先要知道p62这个蛋白，也就是SQSTM1，这个蛋白是自噬相关的。在铁死亡的调控机制中，也会通过和Keap1结合，释放NRF2来应对ROS的产生（p62是通过竞争性结合Keap1，促进NRF2入核激活抗氧化基因转录的，不清楚自噬、铁死亡调控中p62功能的话，可以去看《信号通路是什么鬼？》系列，都介绍过）：
p62的磷酸化调节，其实就是细胞应对ROS氧化应激的一个关键标志，于是他们首先想看看有什么样的途径会激活p62的磷酸化，并且想看看磷酸化的位点具体是哪个。于是他们用了几种细胞应激诱导剂来进行分析，结果发现PA（棕榈酸）刺激后，能激活p62的磷酸化，PA作为脂肪酸其实也和ROS有一定的关联，这个过程中PA激活了p62的S403磷酸化，其实也就是启动了对于ROS脂肪酸氧化的一个抵抗：
那么p62激活还依赖于其通过N末端结构域中K7和D69残基之间的氢键进行二聚化，于是他们分析了一下这个K7和D69二聚化对于S403磷酸化有什么影响，他们通过了对K7和D69的氨基酸突变，来验证了p62的K7和D69二聚化对于其磷酸化的重要性（这里使用了突变，可以有效地论证p62的K7和D69二聚化引起的下游反应，避免肯定后件的逻辑谬误，不清楚肯定后件的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。而同样对S403进行突变后，他们则发现，并没有影响p62二聚化的形成，也就是说p62的K7和D69二聚化是其S403磷酸化的前提：
而他们之前的研究表示，p62在K7位点会被TRIM21泛素化（这是个泛素E3连接酶，也就是将泛素链转移到目标蛋白上的连接酶，不熟悉泛素化的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼？》系列，介绍过泛素化），从而消除了p62的寡聚化。于是他们就想看看TRIM21对于p62的K7位点的泛素化，以及其S403的磷酸化会不会有影响，结果发现TRIM21会通过对p62的K7位点的泛素化，抑制PA诱导激活的p62的S403磷酸化。
那么PA诱导的p62磷酸化又是通过什么激酶激活的呢？他们选择了几个激酶，并通过使用这几种激酶的抑制剂（这其实就是用柯霍氏法则进行的一轮筛选，虽然不够严谨，但也可以通过移除的方法，来确定可能的激酶，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》《轻松的文献导读》和《列文虎克读文献》），来分析具体是那种激酶产生了作用，结果发现TBK1是激活p62的S403磷酸化的关键：
那么接下去的问题就来了PA为什么能在TRIM21存在的情况下，激活p62的S403磷酸化。PA等脂肪酸引起的脂毒性，主要归因于线粒体呼吸增强和过氧化物酶体产生过氧化氢引起的氧化应激，也就是说可能由于氧化反应，导致TRIM21产生了一定的影响。他们发现氧化反应，会促进TRIM21的寡聚化，这个过程可以被DTT之类的还原剂回复。通过对于TRIM21的被氧化位点的分析，他们找到了TRIM21上的C92、C111和C114这三个残基，这三个残基的突变，可以有效抑制TRIM21的寡聚化（通过突变来进行验证，可以把原有的命题外延缩小到三个残基上，在后期的验证过程中，可以进一步避免直接敲减带来的肯定后件逻辑谬误，不清楚肯定后件或者命题的外延和内涵的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列），促进其E3连接酶活性。PA诱导的p62的S403磷酸化以及p62聚集，可以被过表达野生型TRIM21所抑制，而TRIM21的3CS突变体的抑制更甚于野生型：
也就是说PA对于TRIM21的这三个残基的氧化，会促进TRIM21的寡聚化，并使其E3连接酶活性丧失。最后他们进行了TRIM21的缺失验证，发现TRIM21缺失后，PA对于p62-Keap1-NRF2的抗氧化途径的激活更加明显，也就是进一步降低了PA所造成的脂毒性：
最后他们形成这样的示意图，首先PA通过氧化应激导致TRIM21的C92、C111和C114这三个残基氧化，使得TRIM21寡聚化，丧失E3泛素化连接酶功能。当p62的K7残基无法被泛素化后，则会与p62的D69残基结合，使得p62形成二聚体，并通过TBK1激活p62的S403位点磷酸化，从而通过p62-Keap1-NRF2的抗氧化途径的激活，应对PA造成的脂毒性：
这篇文章有意思的地方是他们通过层层推进，将整个故事说得更为完整，又通过对于位点的突变，而不是单纯的敲减或者过表达，来分析具体的作用机制（这一点就已经十分难得了，通过位点的突变，可以更有效地避免肯定后件的逻辑谬误，不清楚肯定后件的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。这篇文章中假设迭代的过程，也是基于他们之前的研究结果来推断的，也就是说这也是一篇不错的延续性研究。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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