本月推出【肺癌液体活检应用特辑】，每周更新，欢迎关注。
众所周知，所有靶向药都不可避免的会出现耐药问题，NSCLC患者无论是一代EGFR-TKI耐药还是三代EGFR-TKI耐药，都需要通过再次活检寻找耐药机制，从而制定下一步的治疗策略。但是，临床上的多次组织活检不仅困难，而且有一定的风险，液体活检作为一种无创、动态的检测手段，可以实现患者耐药情况的实时监测。
本期我们将向大家展示液体活检在NSCLC患者耐药监测方面的应用。
血液检测揭示T790M突变型NSCLC患者对奥西替尼的获得性耐药机制[1]
EGFR激活突变型患者在服用一代EGFR-TKI药物后的一年左右都会发生耐药。研究发现，大约50%的一代EGFR-TKI耐药是由于EGFR基因20号外显子出现T790M突变。针对这种耐药机制，三代EGFR-TKI奥西替尼应运而生，并显示出可喜的疗效，然而奥西替尼的耐药同样不可避免。目前，奥西替尼的耐药机制仍知之甚少，本篇研究就利用NGS的检测方法检测了奥西替尼耐药患者血液中的突变情况，并对奥西替尼的耐药机制进行了探讨。
第一队列选择7名奥西替尼耐药的患者，取治疗前和进展后的血液进行NGS测序；
第二队列选择15名奥西替尼耐药且EGFR-19DEL或EGFR-L858R阳性患者，对T790M及C797S位点进行数字PCR验证。
如图1所示，服用奥西替尼前，患者发现对一代EGFR-TKI耐药，且检测T790M阳性，因此开始服用奥西替尼，六周后，影像学结果表明，患者发生了部分缓解，但是在23周后，患者对奥西替尼耐药，影像学能够看到疾病的进展。通过对患者服用奥西替尼前以及服用奥西替尼进展耐药后的血液进行NGS检测，发现患者进展后产生了一个新的突变，即EGFR-C797S（如图2），初步判断这个突变是奥西替尼的耐药机制之一。
为了进一步验证C797S位点突变是否为奥西替尼的耐药机制，作者将含有常见激活突变19DEL/L858R、一代EGFR-TKI耐药位点T790M以及C797S突变的EGFR基因在老鼠的细胞中表达，结果表明：C797S突变能够显著影响细胞对奥西替尼的敏感性，进一步表明C797S是奥西替尼的耐药机制。
在基本确认C797S位点为奥西替尼耐药机制之后，作者选择了15名EGFR-T790M阳性且对奥西替尼耐药的患者（如表1所示），服用奥西替尼后，用数字PCR的方法对EGFR的激活突变、T790M位点以及C797S位点进行了检测，结果表明：15名患者服用奥西替尼之前仅存在EGFR激活突变以及T790M位点突变，服用奥西替尼之后，所有患者体内仍存在EGFR的激活突变；有6名患者检测出了C797S的突变（40%，图4d）；5名患者体内未检测到C797S，仅存在T790M的突变（33%，图4e）；更有趣的是，另外4名患者（27%，图4f）出现了T790M消失的现象。
本研究通过高精度NGS和数字PCR的测序方法，对第三代EGFR-TKI耐药患者血液中的突变情况进行了分析，结合体外实验结果表明，40%的耐药患者是由于EGFR-C797S的突变， 27%的患者在服用奥西替尼后出现T790M消失的现象。当然，我们最关心的还是奥西替尼耐药后的治疗策略。已有研究表明：若C797S与T790M反式存在（位于不同的等位基因），下一步治疗方式可以选择一代药物与三代药物的联用；但若C797S与T790M为顺式存在（位于同一等位基因上），那么患者对一代和三代药物都是耐药的[2]。目前，对于C797S和T790M的顺式、反式关系，高灵敏度的NGS是首选的检测手段，数字PCR技术只能进行单点检测，还不能判断两个位点的顺式和反式关系。
参考文献
[1]. Thress K S, Paweletz C P, Felip E, et al. Acquired EGFR C797S mediates resistance to AZD9291 in advanced non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M[J]. Nature Medicine, 2015, 21(6):560-2.
[2]. Niederst M J, Hu H, Mulvey H E, et al. The allelic context of the C797S mutation acquired upon treatment with third generation EGFR inhibitors impacts sensitivity to subsequent treatment strategies[J]. Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 2015, 21(17):3924.
Rosell发表在《Nature Reviews》上的一篇文章，概述了ctDNA检测在非小细胞肺癌耐药监测过程中的重要性。目前高灵敏度检测技术（包括NGS和数字PCR技术等）可以实现对血液中EGFR-19DEL、L858R、T790M、C797S突变的高特异性检测，可用于第一代和第三代EGFR-TKI药物的用药指导，以及耐药突变后治疗方案的调整。文章很好的总结了EGFR阳性突变患者的靶向药匹配以及耐药监测流程（图5），简述如下：NSCLC患者初诊（diagnosis）发现EGFR常见激活突变（19DEL和L858R），服用一代或二代EGFR-TKI后，需要再次活检进行耐药监测（disease monitoring）；当出现T790M突变后，根据临床的进展情况，更换三代EGFR-TKI的药物奥西替尼，之后需要进行第三次活检监测耐药；若耐药后发现C797S与T790M反式存在（in trans），则表明下一步可以选择一代和三代药物联用，若C797S与T790M顺式存在（in cis），则表明对EGFR-TKI均耐药。因此，基于NGS技术的液体活检，可作为EGFR突变阳性非小细胞肺癌患者治疗全程管理的必要手段。
泛生子现有的液体活检产品，不仅包括基于NGS技术的多基因检测产品（panel），还包括基于数字PCR技术的基因热点检测产品，全面满足晚期非小细胞肺癌患者靶向药物匹配、预后、耐药及疗效监测的临床需求，从而在各个阶段帮助非小细胞肺癌患者制定精准的个性化治疗方案。
泛生子致力于以覆盖癌症全周期诊疗各个环节（风险评估、早期筛查、分子病理诊断、用药指导和预后监测）的健康管理产品，将基因组学有效应用，协助医疗专家、科研机构等，为癌症患者、癌症高危人群及健康人群，提供可靠的分子诊疗方案、专业的癌症遗传风险评估。
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