天然蛋白纤维是绿色、可持续发展和环保的材料。近年来，天然蓑衣虫丝因其优越的力学性能（拉伸强度~2 GPa）引起了广泛关注。然而，其氨基酸序列中极高的甘氨酸含量、大量的β-纳米晶体重复序列以及高分子量给蛋白异源生物合成带来了挑战，大大限制了其潜在应用探索。因此，利用合成生物学技术实现仿生蓑衣虫丝蛋白生物合成以及多级结构组装是一个迫切需要解决的挑战。为了解决这一难题，清华大学张洪杰院士、刘凯教授团队通过体内聚合和多级自组装策略，开发了杨氏模量~15 GPa的仿生蓑衣虫丝蛋白纤维，超过了许多人工蛋白质纤维，聚合物纤维，甚至天然蜘蛛丝。此外，蛋白纤维优越的力学性能和出色的生物相容性，使其在伤口缝合等生物医学领域具有广阔的应用前景。该研究以题为 “Bagworm Silk-Mimetic Protein Fibers with Extraordinary Stiffness via In Vivo Polymerization and Hierarchical Self-Assembly” 的论文发表在《Advanced Functional Materials》上。
在这项研究工作中，作者选取蓑衣虫丝蛋白核心重复域及其天然N端结构域与不同蜘蛛丝蛋白的C端结构域进行连接，生物合成一系列嵌合蛋白，并进一步通过在嵌合蛋白的两端融合内含肽结构域，获得了更高分子量蛋白质。这些蛋白均在大肠杆菌中成功表达，并利用湿法纺丝技术制备成纤维。值得注意的是，从1升培养物中提取的嵌合蛋白足以制备长达500米长蛋白纤维。
图1. 高性能嵌合蛋白纤维的设计与制备
随后，在25℃、~35%湿度环境下，作者系统地研究了拉伸后嵌合蛋白纤维的力学性能。结果表明，通过精确控制末端结构域，特别是通过引入含有半胱氨酸残基的蛛丝蛋白功能域以及内含肽序列，能够诱导蛋白自组装成富含β-折叠结构的纳米原纤维。这种增强的自组装趋势显著提高了蛋白纤维材料的力学性能，其杨氏模量达15 GPa，超过了众多重组蛋白纤维，甚至天然蜘蛛牵引丝。
研究人员进一步对蛋白纤维内部结构进行了探究。红外光谱显示Int-NBM蛋白纤维的β-sheet含量高达~45.3%，超过了蜘蛛牵引丝。因此，蛋白纤维内有序的分子排列和丰富的β-sheet结构显著增强了蛋白纤维的力学性能。进一步地，利用偏振拉曼光谱评价了拉伸后嵌合蛋白纤维的β-sheet结构在分子水平上的排列。结果显示，Int-NBM蛋白纤维的酰胺I β-sheet峰在垂直位置（IXX）显著高于平行位置（IZZ）。这显示蛋白纤维在垂直于纤维轴方向具有更紧密的β-sheet堆叠，因此进一步提高了Int-NBM蛋白纤维的抗拉伸强度。原子力显微镜成像技术显示NBM主要形成220 nm左右的纳米颗粒，没有明显的纤维网络结构，而NBM-cys和NBF能够自组装成长度分别为0.5 μm和7.5 μm左右的纳米纤维。因此，蛛丝蛋白的ADF3结构域不仅能够通过二硫键增加蛋白分子量，还能促进β-sheet结构的组装和排列。此外，Int-NBM能够组装成更长的纳米原纤维 (~70 μm)，表明内含肽介导的聚合显著促进了蛋白的自组装动力学。随后，作者使用硫黄素-T (ThT) 荧光探针来评估β-sheet结构的含量和自组装效率。NBM蛋白的荧光强度最低，而Int-NBM蛋白的荧光强度最高，表明Int-NBM蛋白的β-sheet含量较高，自组装动力学速度较快。上述结果表明Int-NBM高效组装动力学赋予蛋白纤维丰富的β-sheet含量、有序的分子排列和更高的力学性能。作者进一步验证了材料的生物安全性，研究发现：与Int-NBM蛋白纤维共培养24小时后，几乎所有的细胞都能存活，即使是粘附在纤维表面的细胞也是如此。随后，作者将蛋白纤维用于大鼠背部皮肤伤口愈合实验。相较于其他各组，Int-NBM蛋白纤维能有效促进皮肤再生，7天后创面迅速愈合，无明显缺陷。H&E和Masson染色结果显示，蛋白纤维处理过的皮肤伤口形成了更多的毛囊和皮脂腺，且在整个伤口愈合过程中几乎没有炎症反应，效果明显优于未处理组和商用手术缝合线组。因此蛋白纤维成为伤口缝合和修复的一个有吸引力的候选材料。总结：作者开发了一种模块化的组装策略，利用基因工程技术，将蓑衣虫丝蛋白和蜘蛛丝蛋白序列进行重组，制备了高模量蛋白纤维。该嵌合蛋白具有分子量小、序列重复性低的特点，非常适合用于微生物系统中的高产量合成。进一步地，通过调控末端结构域能够精确控制嵌合蛋白的自组装行为。此外，所开发的仿生蓑衣虫丝蛋白纤维优越的力学性能和出色的生物相容性使其非常适合用于伤口缝合，在生物医学领域展示出广阔的应用前景。声明：仅代表作者个人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下方留言指正！
