What？高手已经在组织切片上做流式了？

摄影师用相机讲述生活，作家用文字记录情感。

而科研人员，能透过事物的表像，记录最真实的图像信息。从每个细胞的大小、形态、到生长阶段、DNA 多少、生物标志物等等，均可一览无余。

Cytometry 技术是一种表征细胞特征的测量方法。 Cytometry 技术囊括了细胞的大小、细胞形态（形状和结构）、细胞周期阶段、DNA 含量以及细胞标志物检测、分类、统计等更加多样的定量分析应用。

其应用领域也是进一步外延，在人类、动物、植物、微生物研究、细胞生物学研究以及医学诊断领域得到广泛应用。而 Cytometry 技术本身也因为融入技术的不同逐渐形成了不同的分支，大体可以概括为悬浮细胞检测的 Flow Cytometry 及细胞显微成像为基础的 Image Cytometry 两类。

流式细胞术是目前细胞组织水平定量研究最常用的技术，能够分析细胞表面和细胞内分子的表达、鉴定并确定异质细胞群中的不同细胞类型、评估分离亚群的纯度等，在科研，临床中应用极为广泛。

但是，流式细胞检测要求样本必须是细胞悬液，对于实体组织而言，处理成细胞悬液后细胞所处的组织原位数据信息、细胞形态信息、不同细胞间的分布关系信息全部丢失，处理过程也会不可避免的对细胞产生无法预知的影响，增加了结果的不可靠性，且无法对圈选范围进行验证。而基于免疫组化，免疫荧光等标记技术的组织显微成像，虽可以明确的获得细胞的位置形态信息，但镜下直接人工计数效率低下、准确性也很难保证。

20 世纪 90 年代中期，随着数码相机的出现，以图像为基础的 Image Cytometry 技术也由人工分析逐步进入机器分析时代。但是基于单视野分析的常规技术只能获得极少比例组织图像信息，代表性差，真实性难以保证。

针对 Image Cytometry 的问题，TissueGnostics 公司在本世纪初创造性的推出了结合组织全景成像和专利单细胞识别量化分析的 TissueFAXS Cytometry 技术。解决了传统技术单视野分析的局限性以及细胞识别准确性问题，同时实现了图像细胞形态、位置信息量化。

TissueFAXS Cytometry 不仅把分析结果和数据丰度提升到流式细胞术的水平，同时提供了比流式更加丰富的细胞形态、原位量化信息，将 Image Cytometry 推向了新的阶段。

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那么，基于组织原位进行成像及分析的 TissueFAXS Cytometry，是否能真正的像 Flow Cytometry 一样，能进行多参数精确的数据呈现呢？

作为全景组织细胞定量分析的基础，如何在具有多层细胞结构的组织原位中准确识别到有效细胞，排除背景信号、非特异性染色的杂质以及无效的细胞碎片，一直是基于图像的组织原位单细胞定量分析的难题。

传统 Image Cytometry 技术是基于简单阈值，水痕等方法，细胞识别误差较大，统计结果准确性难以保证，无法满足准确定量的实际科研需求。

TissueFAXS Cytometry 专利的单细胞识别技术，可以做到准确识别组织内差异性明显的，不同大小、不同染色强度、不同形态的细胞核、质、膜等多种单细胞结构，保证了细胞统计准确性，为后续量化分析奠定了坚实基础。

除细胞染色形态的差异外，由于组织原位细胞间存在相互接触, 阳性细胞会和阴性细胞常常会贴合在一起，造成阴性细胞（A）周围存在阳性着色。TissueFAXS Cytometry 独特的包裹性细胞质、细胞膜染色判读方法，通过每个细胞周围信号分布包裹性特征准确将 A 划分为阴性，B 为阳性。

TissueFAXS Cytometry 技术对单细胞识别的准确性，早在 2006 年，已由奥地利 TissueGnostics 公司 CEO Dr.Rupert 做为第一作者与维也纳医学院的专家发表文章证明。文章标题 An Improved Method for Discrimination of Cell Populations in Tissue Sections Using Microscopy-Based Multicolor Tissue Cytometry，发表于 International Society for Analytical Cytology 上。

研究人员将 MMTC（TissueFAXS Cytometry 曾用名 Microscopy-based multicolor tissue cytometry 缩写）与 FACS 方法进行比较, 检测相同样本来源各表型淋巴细胞的阳性率。

实验结果（Fig. 1）表明，MMTC 与 FACS 的百分比数值吻合度较高，其中显著性水平 p=0.01, 斜率 K=0.981。由此可以看出 TissueFAXS Cytometry 技术（MMTC）和 Flow Cytometry（FACS）的准确率是一致的，数据真实度值得信赖。

一套完善的定量分析技术，一定会拥有一整套完善的实现流程，以及由相关的定量分析技术组成。如下图所示，全景组织细胞定量分析技术的工作流程与 TissueFAXS Cytometry 的技术构成。

通过下面的一些案例，大家可以体验到 TissueFAXS Cytometry 技术的独特魅力

1. 从低倍镜到高倍油镜获取的超大尺寸全景图像

基于超大尺寸病理切片的全景获取技术，能够支撑高通量大数据影像学数据分析，为珍贵超大样本数字化拷贝、散在不均匀分布的稀有细胞分析，为多学科交叉研究获取更高丰度的精准定量分析数据提供研究条件。

三色荧光神经细胞爬片

63X 油镜共聚焦扫描样本（HIV 感染巨噬细胞）

2. 数据双向独立可重复验证

图像到数据的正向分析和数据结果到图像的反向回溯验证。通过原始图像与数据图/数据表格的实时联动，无论在识别精度、染色阳性率划分的阈值还是追溯阳性信号在组织中的原位信息的准确度都可以得到保证。

3. 亚细胞结构定量

TissueFAXS Cytometry 技术除了单细胞识别外，可自动识别标记的肌动蛋白微丝，将其划分为不同分布位置群体，进行长度、数量、强度和曲率等分析。亚结构分析功能同样适用于 RNA scope、FISH、染色体端粒、神经树突轴突分析等应用。

4. 组织微环境信号空间分布及细胞表型分类数字定量

多色标记不同表型的淋巴细胞是研究肿瘤微环境免疫状态的常用方法。借助 TissueFAXS 系统量化组织切片中每个细胞核、质、膜着色，利用散点图判断多 marker 共表达情况，可以轻松实现细胞表型分类。

对细胞-细胞、细胞-组织、组织-组织之间的空间位置关系进行统一量化分析，提取包括空间分布信息、聚集游走趋势等数据，进而进行大数据分析。例如肿瘤微环境内细胞分布模式、不同细胞间位置关系、细胞骨架在细胞内外的分布情况、探索胞内原生生物与宿主细胞的关系研究等等。

5. 荧光样本 λ- stack 成像及光谱拆分（小鼠完整淋巴结全景成像（5 色））

通过 λ- stack 成像获取多光谱数据后，依照荧光光谱库，拆分多色光谱信号并扣除自发荧光背景后得到所有标记的荧光纯净图像。

文章来源：TissueGnostics Asia Pacific Limited

题图来源：站酷海洛

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