周末研读 | 修改超范围的判断标准——简评“用于修饰核酸的转座子末端组合物和方法”专利无效案

决定要点

       原始申请文件记载的范围包括本领域技术人员依据原说明书和权利要求书明确记载的信息，从申请人真实意思表示的角度“直接地、毫无疑义地”确定的申请文件客观、准确表达的技术信息集合。在确定申请文件客观、准确表达的技术信息集合的过程中，不能仅从文字表面机械地去理解，而应当从本领域技术人员的视角进行综合判断。如果修改后的技术方案没有超出上述技术信息集合，则这种修改没有超出原说明书和权利要求书记载的范围。

       如果根据本领域技术人员的通常理解可以确定权利要求中术语的含义，并且该术语与权利要求中的其他表述不存在矛盾，则该术语不会导致权利要求的保护范围不清楚。

       在判断权利要求是否缺少必要技术特征时，既要考虑权利要求以文字形式直接体现的技术特征，也要考虑文字背后是否隐含有其他技术特征。

       在判断说明书是否充分公开发明的技术方案时，需要在全面整体理解发明内容的基础上，准确确定发明要解决的技术问题。如果发明在解决技术问题的过程中，伴随产生了一些副产品或副反应，但所述副产品或副反应的存在不会导致整个发明目的无法实现或技术问题无法解决，则无法仅因为副产品或副反应的存在就得出说明书公开不充分的结论。同样，也无法在此基础上进一步得出权利要求得不到说明书支持的结论。

       如果发明要求保护的技术方案符合自然规律和本领域的技术逻辑，能够在产业上制造和使用，且能够解决技术问题，则满足实用性的要求。

       如果权利要求的技术方案与现有技术中公开的技术方案相比较，因存在区别技术特征而实质上不相同，则该权利要求具备新颖性。

       发明构思是发明人为解决技术问题而提出的技术改进思路，在评判权利要求创造性的过程中，通常需要结合发明构思，从整体角度对本专利和现有技术中的技术方案进行对比和分析，判断现有技术是否给出了引入区别技术特征以解决相应技术问题的技术启示。

中华人民共和国国家知识产权局专利复审委员会

无效宣告请求审查决定(第34283号)

发明创造名称：用于修饰核酸的转座子末端组合物和方法

案件编号：第4W106103号

决定日：2017年12月15日

专利号：200980152461.8

申请日：2009年10月24日

授权公告日：2015年08月12日

无效宣告请求日：2017年07月31日

国际分类号：C12P 19/34，C07H 21/00，C12N 9/00

法律依据：专利法第33条，第22条第2、3、4款，第26条第3、4款；专利法实施细则第20条第1款、第21条第2款

决定的理由

 关于审查基础

       本无效宣告请求审查决定以本专利授权公告的文本为审查基础，权利要求书如下：

证据认定

关于专利法第33条

       专利法第33条规定，申请人可以对其专利申请文件进行修改，但是对发明和实用新型专利申请文件的修改不得超出原说明书和权利要求书记载的范围。

       原始申请文件记载的范围包括本领域技术人员依据原说明书和权利要求书明确记载的信息，从申请人真实意思表示的角度“直接地、毫无疑义地”确定的申请文件客观、准确表达的技术信息集合。在确定申请文件客观、准确表达的技术信息集合的过程中，不能仅从文字表面机械地去理解，而应当从本领域技术人员的视角进行综合判断。如果修改后的技术方案没有超出上述技术信息集合，则这种修改没有超出原说明书和权利要求书记载的范围。

请求人认为：

       权利要求1-16修改超范围的理由为：①本专利权利要求1和10涵盖了标签序列在转座子末端序列5′和3′端的技术方案，而根据附件2所示的本专利申请公开文本的记载只能确定标签序列在转座子末端序列的5′端，从附件3可以看出专利权人也认可标签序列在转座子末端序列的5′端，3′端是转座子末端序列；②原始申请文件仅记载了特定孵育条件，权利要求1中采用上位概括方式限定的孵育条件涵盖了原始申请文件中未记载的其他条件；③权利要求3、12中的“所述转座体复合物包含不同的序列”不仅包含了“转移链具有不同序列”的技术方案，而且涵盖了“转移链具有相同序列，但非转移链具有不同序列”的技术方案，而说明书中只记载了标签序列不同的技术方案；④权利要求5附加技术特征部分（4）和（5）的“连接酶”未进行进一步限定，而原始申请文件记载的是“依赖模板的连接酶”。

合议组认为：

       对于理由①，合议组认为，结合本专利说明书的描述和本领域的公知常识可知，Tn5转座酶及其转座机制是本领域所公知的。在转座过程中，Tn5转座酶催化转座子末端序列插入靶DNA中导致该转移的转座子末端与靶DNA的一条链的5′端接合，同时该链在该转移的转座子末端序列与该靶DNA的接合位点处的破裂或断裂，伴随产生由于在靶DNA的相反链中的9碱基缺口区域所致的位于转移的转座子末端与靶DNA接合的位点的3′的单链靶DNA的9碱基区域（可以参见附件2所示的说明书第359段），由此为了使标签序列能够连接到新形成的靶DNA片段上，标签序列必需与转座子末端序列的5′端连接，对此，请求人在口审当庭也表示认可；而且，本专利说明书附图4显示转移的转座子末端寡核苷酸在其5′部分显示不同的标签序列，同时附图8、10和13也明确表明标签序列位于转座子末端序列的5′端，附件3的内容也说明标签序列在转座子末端序列5′端。因此，本领域技术人员根据本专利说明书和附图的记载以及本领域的公知常识可以直接毫无疑义地确定，标签序列位于转座子末端序列的5′末端是基于Tn5转座酶转座原理实现将靶DNA断裂并连接标签序列的必然要求。虽然权利要求1和10中没有限定标签序列的位置，从文字表面来看其似乎包含了标签序列在转座子末端序列3′端的情形，但结合本专利的发明目的和本领域公知的转座酶的转座原理，本领域技术人员能够确定权利要求并不包含标签序列位于转座子末端序列的3′端这种技术上不符合逻辑的技术方案，请求人关于修改权利要求超范围的理由①不成立。

       对于理由②，合议组认为，本专利说明书第020段记载了“本发明提供了用于产生靶DNA的加标签的DNA片段的文库的方法，所述方法包括将该靶DNA与转座酶和转座子末端或转座子末端组合物一起孵育，所述转座子末端或转座子末端组合物包含在5′部分中具有标签结构域的转移链，所述孵育是在如下条件下进行：其中转座酶催化转座反应，并且其中靶DNA断裂产生多个靶DNA片段，并且所述转座子末端或转座子末端组合物的转移链与所述多个靶DNA片段中的每一个片段的5′端接合，以产生多个5′加标签的靶DNA 片段”。即说明书中记载了所述孵育条件即是实现使靶DNA断裂、并将转座子末端或其组合物的转移链连接至靶DNA片段5′末端的转座反应条件的内容，上述内容与权利要求1中记载的“所述靶DNA被断裂成双链DNA片段且所述第一多核苷酸或所述第二多核苷酸之一连接至所述DNA片段的每个末端的条件下孵育”的差异仅在于文字表述，两者含义并没有根本不同。说明书在上述内容后进一步描述的反应过程仅是制备单链5′和3′端具有标签的片段时所进行的填充缺口的额外反应条件，并非转座反应的具体特定条件，实际上，说明书第096和097段记载了“在本发明的方法的实施方案中的一个重要步骤是使用体外转座反应将靶DNA断裂并加标签以产生加标签的DNA片段。体外转座反应需要转座酶、转座子末端组合物以及适合的反应条件”和“‘转座酶’表示如下的酶：该酶能够与包含转座子末端的组合物(例如，转座子、转座子末端、转座子末端组合物)形成功能复合物并催化该包含转座子末端的组合物插入或转座进入在体外转座反应中与该酶孵育的双链靶DNA中”，由上述记载可以确定转座反应的条件。本领域技术人员根据说明书的上述记载可以直接毫无疑义地确定权利要求中记载的所述内容，请求人认为说明书记载的是具体特定的条件，而权利要求1限定的是上位概括的孵育条件，因此权利要求修改超范围的理由②不成立。

       对于理由③，合议组认为：权利要求3、12中的所述转座体复合物分别包含含Tn5转座子末端序列及第一或第二标签序列的第一多核苷酸和第二多核苷酸，本专利附图4和附图8示出了连接到两个转座子末端序列的5′末端的标签序列可以是不同的，即转移链具有不同的标签序列；说明书第186段记载了“在其中使用两种不同的转座体的一些优选的实施方案中，这两种不同的转座体各自包括相同的转座酶并且转座子末端组合物包含不同的转移链”，说明书第295段记载“不同的双链转座子末端的每一个都包含具有5′部分和3′部分的不同的转移链，其中每个不同的转移链的5′部分显示不同的期望的标签序列别且该3′部分显示相应的转移的转座子末端序列”；由此可见，虽然转座子末端序列相同，但不同标签序列的存在使得第一第二多核苷酸序列整体并不相同，本领域技术人员结合转座酶的转座原理和说明书的记载可以理解权利要求3、12中“所述转座体复合物包含不同的序列”实质是指转座体复合物的转移链包含不同的标签序列，并不包含转移链序列相同而非转移链序列不同的技术方案。因此请求人认为权利要求3、12涵盖了“转移链具有相同序列但非转移链具有不同序列”的技术方案因而修改超范围的理由③不成立。

       对于理由④，合议组认为：权利要求5中使用连接酶的目的是使3′标签与所述5′加标签的靶DNA片段的 3′端接合以产生加双标签的靶DNA片段（参见说明书第020、021段，附图8、10、13和18），所述接合反应并非对5′加标签的双链靶DNA片段的任意连接和延长，而是在依赖模板的条件下根据5′加标签的转移链的序列对缺口的补足和延长。本领域技术人员依据说明书的上述记载和本领域公知的连接酶反应过程中以模板作为参照的原理可以直接毫无疑义的确定权利要求5中的“连接酶”应当是依赖模板的连接酶，请求人关于修改超范围的理由④不成立。

      综上所述，请求人认为权利要求1-16修改超范围的无效理由均不成立。

关于专利法实施细则第20条第1款

       专利法实施细则第20条第1款规定，权利要求书应当说明发明或者实用新型的技术特征，清楚并简要地表述请求保护的范围。

       如果根据本领域技术人员的通常理解可以确定权利要求中术语的含义，并且该术语与权利要求中的其他表述不存在矛盾，则该术语不会导致权利要求的保护范围不清楚。

请求人认为：

      权利要求1-16的保护范围不清楚的理由是：（1）术语“高活性Tn5转座酶”的含义不清楚，虽然附件4、5、7和14中涉及的是具体的Tn5转座酶突变体，其具有相对较高的活性，但其中也并没有排除野生型的Tn5转座酶。而且，反证2没有限定高活性的范围；反证4中没有对术语“高活性Tn5转座酶”进行定义；（2）“在其中所述靶DNA被断裂成双链DNA片段且所述第一多核苷酸或所述第二多核苷酸之一连接至所述DNA片段的每个末端的条件下”没有清楚限定孵育条件；（3）权利要求1中表述“所述第一多核苷酸或所述第二多核苷酸之一连接至所述DNA片段的每个末端”与表述“从而产生具有第一标签序列和第二标签序列的DNA片段的文库”相互矛盾。

合议组认为：

     （1）首先，本专利说明书第0165段记载了“这种转座方法通过利用如下复合物举例说明：使用与(Goryshin，I.和Reznikoff W. S.，J. Biol. Chem.，273：7367，1998，即反证2)所述的方法类似的方法由高活性Tn5 转座酶和适合的Tn5型转座子末端组合物所形成的转座复合物或由 HyperMuTM高活性MuA转座酶(EPICENTRE，Madison，WI)和显示由该转座酶识别的R1和R2末端序列的适合的MuA转座子末端组合物所形成的转座复合物”，即说明书中记载了“高活性Tn5转座酶”；其次，本领域技术人员通常将“高活性的酶”这种表述方式理解为相对于野生型的相应酶具备更高活性的酶，专利权人也明确指出“高活性的Tn5转座酶”是指相对于野生型Tn5转座酶来说活性更高的Tn5转座酶，无效请求人在口审当庭也承认，其在进行新颖性和创造性比对过程中也将这一表述理解为以野生型作为对比参照的形式。而且，反证2和附件4、5、7和14中均公开了Tn5转座酶突变体，虽然上述文献以及反证4中均未对高活性的Tn5转座酶进行具体的定义，但从其文字记载来看，其中所提及的具体的高活性的Tn5转座酶基本上都是相对于野生型Tn5转座酶来说的。按照本领域的通常理解方式和相关文献中记载的参考信息，本领域技术人员可以确定高活性Tn5转座酶所涵盖的范围，其含义是清楚的。（2）如上所述，权利要求1限定的孵育条件指的是实现使靶DNA断裂、并将转座子末端或其组合物的转移链连接至靶DNA片段5′末端的转座反应条件，结合说明书的描述和本领域公知的Tn5转座酶催化转座反应的发生过程、反应条件、所需材料等，本领域技术人员可以理解“在其中所述靶DNA被断裂成双链DNA片段且所述第一多核苷酸或所述第二多核苷酸之一连接至所述DNA片段的每个末端的条件下”的表述方式所限定的孵育条件。（3）权利要求1中的表述“所述第一多核苷酸或所述第二多核苷酸之一连接至所述DNA片段的每个末端”指的是经断裂的双链DNA片段的每个5′末端连接有一个标签，最终会产生三种类型的DNA片段，即两端连第一标签的DNA片段、两端连第二标签的DNA片段和一端连第一标签另一端连第二标签的DNA片段，因此，其含义与 “从而产生具有第一标签序列和第二标签序列的DNA片段的文库”的表述是一致的，两者之间并无矛盾。因此请求人有关权利要求1-16的保护范围不清楚的理由不成立。

专利法实施细则第21条第2款

       专利法实施细则第21条第2款规定，独立权利要求应当从整体上反映发明或者使用新型的技术方案，记载解决技术问题的必要技术特征。

       在判断权利要求是否缺少必要技术特征时，既要考虑权利要求以文字形式直接体现的技术特征，也要考虑文字背后是否隐含有其他技术特征。

请求人认为：

      独立权利要求1和10中未限定标签序列位于转座子末端序列的5′端，因此缺少必要技术特征。

合议组认为：

      权利要求1和10中虽然没有限定标签序列位于转座子末端序列的哪一端，但如上所述，本领域技术人员结合说明书的记载和本领域公知的转座机理可以直接毫无疑义地确定权利要求1和10中的标签序列位于转座子末端序列的5′端，因此请求人该无效理由不成立。

关于专利法第26条第3、4款

       专利法第26条第3款规定，说明书应当对发明或者实用新型作出清楚、完整的说明，以所属技术领域的技术人员能够实现为准。

       专利法第26条第4款规定，权利要求书应当以说明书为依据，说明要求专利保护的范围。

       判断说明书是否充分公开发明的技术方案时，需要在全面整体理解发明内容的基础上，准确确定发明要解决的技术问题。如果发明在解决技术问题的过程中，伴随产生了一些副产品或副反应，但所述副产品或副反应的存在不会导致整个发明目的无法实现或技术问题无法解决，则无法仅因为副产品或副反应的存在就得出说明书公开不充分的结论。同样，也无法在此基础上进一步得出权利要求得不到说明书支持的结论。

请求人认为：

       权利要求1-16得不到说明书支持和说明书公开不充分的理由为：权利要求1中的“在其中所述靶DNA被断裂成双链DNA片段且所述第一多核苷酸或所述第二多核苷酸之一连接至所述DNA片段的每个末端的条件下”是对技术效果的限定和描述，当靶DNA为线性DNA时，靶DNA本身的两末端的DNA片段不可能在其每个末端都连接有标签序列，而权利要求1中并未限定靶DNA不包括线性核酸分子；而且标签序列只能位于转座子末端序列的5′端，而权利要求中未限定标签序列与转座子末端序列的位置关系。

合议组认为：

       判断说明书公开是否符合专利法第26条第3款的规定以及权利要求书是否得到说明书的支持，均需要从本领域技术人员的角度出发，在说明书公开内容的基础上，结合本领域技术人员所应当具备的知识和能力进行判断。根据本专利说明书中描述的原理，一个或多个转座体复合物转座至靶DNA中，导致靶DNA断裂成多个双链DNA片段，且转座体复合物中所携带的标签序列被连接至所产生的DNA片段的末端，最终形成大小不一的末端连接有标签序列的DNA片段文库。当靶DNA为线性DNA时，所产生的包含靶DNA自身的5′和3′末端的DNA片段只可能在其5′端连接有标签序列，而不可能在其每个末端都连接有标签序列，而且本专利说明书第129段记载“对于预定的目的或应用来说，可接受显示靶DNA的某些部分或区域的序列的加标签的DNA片段的低频率或缺乏”，即说明书中公开了文库中存在低频率的未连接有标签的靶DNA末端序列是可以接受的，线性靶DNA自身最末端所产生的仅具有一个标签的那些低频率形式存在的片段并不会影响通过转座得到文库中其他大量的末端连接有标签序列的DNA片段的过程以至于影响发明目的的实现。此外，如上所述，本领域技术人员可以直接毫无疑义地确定权利要求1和10中的标签序列位于转座子末端序列的5′端。因此请求人关于说明书公开不充分和权利要求1-16得不到说明书支持的理由不成立。

关于专利法第22条第4款

       专利法第22条第4款规定，实用性，是指该发明或者实用新型能够制造或者使用，并且能够产生积极效果。

       如果发明要求保护的技术方案符合自然规律和本领域的技术逻辑，能够在产业上制造和使用，且能够解决技术问题，则满足实用性的要求。

请求人认为：

       权利要求1-9不具备实用性的理由是当靶DNA为线性DNA时，靶DNA本身的两末端的DNA片段不可能在其每个末端都连接有标签序列，因此所要求保护的方法无法实施，无法在产业上制造或使用。

合议组认为：

      根据前述关于专利法第26条第3、4款的评述意见可知，权利要求1涉及产生具有第一标签序列和第二标签序列的DNA片段的文库的方法，但并不要求经转座反应断裂的每个DNA片段均包含第一和第二双标签序列，线性靶DNA自身的最末端产生的且仅具有一个标签的片段并不会影响发明目的的实现，而且如果有必要也可以从所述文库中排除，因此权利要求1-9的方法能够实施，可以在产业上制造或使用。请求人有关权利要求1-9不具备实用性的无效理由不成立。

关于新颖性

       专利法第22条第2款规定，新颖性，是指在申请日以前没有同样的发明或者实用新型在国内外出版物上公开发表过、在国内公开使用过或者以其他方式为公众所知，也没有同样的发明或者实用新型由他人向国务院行政部门提出过申请并记载在申请日以后公布的专利申请文件中。

       如果权利要求的技术方案与现有技术中公开的技术方案相比较，因存在区别技术特征而实质上不相同，则该权利要求具备新颖性。

       本案中，权利要求1-16分别请求保护包含多种转座体复合物的组合物以及利用其产生具有第一标签序列和第二标签序列的DNA片段的文库的方法，其中涉及的转座体复合物包含高活性Tn5转座酶和含Tn5转座子末端序列及第一或第二标签序列的第一多核苷酸或第二多核苷酸，由此可见，所述多核苷酸包含两个彼此连接的独立组成部分，转座子末端序列和标签序列，而且根据本专利说明书对标签的定义可知（参见说明书第092段），所述标签是为与其接合的转座子末端序列提供寻址手段的非靶核酸组分，一般为DNA。因此，本专利所述的标签序列并非靶DNA序列，而且为了实现特定的寻址目的所设计的序列，所述标签序列也不能是转座子末端序列本身或其在供体序列基础上的任意延伸。

      权利要求10请求保护包含多种转座体复合物的组合物。附件4涉及在含有突变E54K和L372P的高活性型Tnp的基础上构建三个单突变的突变体，通过测定突变体在转座步骤中与模拟天然底物的寡核苷酸形成配对末端复合物（PEC）以及催化转座反应的能力，以确定Tn5转座中形成配对末端复合物和发挥催化活性所需要的空间要求，其中具体公开了利用上述突变体、相应的底物以及其他成分来进行转座反应的反应过程（参见附件4第1904页、1906页中文译文）。

请求人认为：

      附件4公开了一种配对末端复合物（PEC），其包括Tnp蛋白和DNA底物，所述Tnp蛋白的底物DNA链含有Tn5转座子末端序列以及额外的已知序列，由于权利要求10中没有限定标签序列，依据本领域对标签序列的一般定义（参见附件15）可以确定，附件4公开的DNA底物中，连接至转座子末端序列的3′或5′末端的其他寡核苷酸序列可以用作标签序列，用于鉴定和/或追踪多聚核苷酸。因此，权利要求10不具备新颖性。

合议组认为：

      首先，从附件4记载的整体内容来看，其目的是通过测试Tnp突变体与各种DNA底物（供体）形成突触复合物的能力，来探索Tn5转座酶活性位点的几何形状对形成配对突触复合物和催化切割供体的能力的影响，其中并没有记载包含多种转座体复合物或配对末端复合物的组合物。虽然请求人认为在体外催化反应中，Tnp与加入的DNA底物反应会形成包含转座体复合物的组合物，但附件4的研究目标是通过研究形成配对末端复合物的能力来确定Tn5转座酶实现所述转座反应所需的活性部位空间结构，并不涉及以制备该组合物作为目标产物的制备过程，而且所述催化反应是一个动态的反应过程，虽然在反应过程中会有产生类似所述组合物的类似中间状态，但该中间状态仅是反应过程中的临时状态，附件4中并没有公开将该处于反应中间过程中的上述临时状态的产品分离出来作为独立产品的内容，因此，附件4并没有公开权利要求10请求保护的组合物。其次，虽然附件4所示作为DNA底物的转移链中ME序列5′端含有供体DNA序列(参见请求人提交的附件4的中文译文第2页) ，但附件4中没有具体说明ME序列5′端 “供体DNA”序列的具体用途。结合附件4所述DNA底物的制备过程和图4所示的催化检测原理可知，附件4中起类似标签作用的是寡核苷酸5′末端的32P标记，在附件4并未提及“供体DNA”具体用途的情况下，无法确定附件4中DNA底物中额外的供体DNA序列就是权利要求10中所述为了实现特定寻址目的而设计添加的非靶DNA标签序列。再次，虽然附件15中提及了标签的含义，但一方面，附件15是一篇专利文献，其并非公知常识证据，其中对标签的定义只是为了清楚说明其自身要求保护的技术方案，直接用附件15中的定义来解释本专利权利要求中的术语缺乏依据：另一方面，如上所述，本专利说明书中已经对标签进行了相应的定义。在理解权利要求中某种表述方式的含义时，如果说明书中指明相应表述方式的特定含义，则在权利要求的解读中应当结合说明书的特定定义进行理解。综上，由于附件4中的中间产物PEC不相当于权利要求10中的转座体复合物，附件4中也并未公开权利要求10中的标签序列，因此权利要求10相对于附件4具备新颖性，相应的，从属权利要求13相对于附件4也具备新颖性。

      附件5公开了测定Tn5转座酶诱导的DNA底物切割反应的过程，在该切割反应过程中，需要使用转座酶/整合酶、包含转座酶识别序列的核酸片段、以及其他反应试剂等，其中，包含转座酶识别序列的核酸片段是经标记的供体DNA片段，其包含5′荧光标记的供体DNA和转座子DNA，转座子DNA包含Tnp识别序列和其他序列，其中荧光标记的DNA供体序列在转座过程中被剪切掉从而作为检测切割反应发生程度的检测指标而被检测（参见附件5图1）。

请求人认为：

      附件5公开了一种包含两分子的转座酶/整合酶和两个核酸片段的模型系统，其中每个片段包含一个转座酶/整合酶识别序列（参见附件5译文第2页），图1A公开了一个转座酶/整合酶识别序列的片段，其包含Tn5转座酶识别序列和经标记的供体DNA，依据附件15中有关寡核苷酸标签的定义，附件5中经标记的供体DNA可以用作标签，用于鉴定和/或追踪整个核酸片段。附件14又公开了附件5中使用的是高活性的Tn5转座酶，因此附件5公开的转座体复合物相当于权利要求10的转座体复合物。

合议组认为：

      首先，如上所述，在本专利说明书中已经指明权利要求中技术术语的特定含义的情况下，应当结合说明书的特定定义来理解，而不能用附件15的定义来解释本专利权利要求中的术语。其次，虽然附件5涉及Tn5转座酶诱导的DNA底物切割反应，但其和附件4均侧重于反应过程的检测，其同样没有记载包含多种转座体复合物的组合物，而且附件5中公开的经标记的供体DNA片段作为一个整体参与转座反应，其中荧光标记的DNA供体序列在转座过程中被剪切掉，并不会被转座连接到靶DNA上，因此荧光标记的DNA供体序列并不是权利要求10中限定的能实现寻址目的的标签序列。综上可见，附件5所公开的模型系统不相当于权利要求10的转座体复合物，而且其中也并没有公开权利要求10中的标签序列，权利要求10相对于附件5具备新颖性。

       附件6公开了一种将更大的DNA区段碎片成片段，以使得能够通过使用一个或几个测序引物对整个区段进行测序的方法（参见附件6译文第2页第5段），其中实施方案C包括如下步骤：a）用于扩增引物的两个不同位点通过转座插入靶DNA；b）通过使用两个选择性引物作为扩增引物进行选择性扩增反应；c）通过本领域已知方法基于其大小分离扩增产物；d）扩增产物位于靶DNA的随机位置，选择足够量的特异性扩增产物用作测序模板以覆盖靶DNA的整个序列。结合附图2可知，步骤a）涉及提供待测序的靶DNA，具有两个不同末端的转座子DNA、转座酶和缓冲液，将上述组分一起孵育，从而将靶DNA片段化，并在所产生的DNA片段的2个末端分别连接上转座子DNA的末端，同时为了确保足够数量的分子具有两个转座子命中，优选具有比在实施方案A和B中更高效的转座反应，用于扩增引物的两个不同位点通过转座插入靶DNA，转座反应通过使用转座子来进行，所述转座子具有不同末端，从而使得能够为两端设计不同的选择性引物，转座子末端可以是同一分子的部分或两个单独的转座子分子的部分（参见附件6的图2、译文第10-11页）。

请求人认为：

       附件6实施方案A中公开了可以使用的转座系统包括Tn5转座酶，而实施方案C强调优选具有比在实施方案A和B中更高效的转座反应，由此可见，附件6明确公开在实施方案C中使用高活性Tn5转座酶；此外结合附图2以及附件6中“转座子”、“转座子连接末端”等术语的定义，可以理解附件6实施方案C中包含不同末端的转座子相当于权利要求1中含Tn5型转座子末端序列及第一或第二标签序列的第一或第二多核苷酸。因此权利要求1相对于附件6不具备新颖性。

合议组认为：

       首先，附件6的方法是具体的测序方法，虽然在该测序方法中，靶序列客观上因为转座反应的发生会在中间发生断裂而产生不同大小的片段，但其得到片段的目的是为了通过后续的选择性扩增实现进一步测序，其中并没有提到构建能够适用于下一代测序方法的DNA文库的相关内容。其次，附件6仅以列举的方式提及在转座方法中可以使用包括Tn5转座酶在内的转座系统，虽然实施方案C中提到为了确保足够数量的分子具有两个转座子命中，优选具有比在实施方案A和B中更高效的转座反应，但对本领域技术人员而言，更高效的转座反应并不意味着即是选择高活性的转座酶，影响转座效率的因素有许多，具体包括是否存在金属离子或其他辅助因子、酶的性质、反应条件等，作为评价新颖性的现有技术应当是对比文件中客观描述的一个完整技术方案，不能是多个技术方案的组合，或是对客观描述的现有技术内容提炼加工后可能存在的多个技术方案之一，因而，并不能根据附件6公开的内容确定其中的实施方案C使用的是高活性Tn5转座酶。再次，附件6实施方案C公开的是具有不同末端的转座子，转座子末端可以是同一分子的部分或两个单独的转座子分子的部分，转座子末端作为不同的扩增引物的识别位点，可见附件6中通过转座插入靶DNA以作为后续设计扩增引物的两个不同位点均是转座子的不同末端序列，其并没有在转座子末端序列的基础上另外连接用作标签的序列，而权利要求1中与转座子末端序列连接的标签序列是独立于转座子末端序列的结构单元，因此附件6实施方案C也未公开权利要求1的标签序列，其包含不同末端的转座子不能相当于权利要求1中的含Tn5型转座子末端序列及第一或第二标签序列的第一或第二多核苷酸。所以权利要求1相对于附件6具备新颖性。在此基础上，从属于权利要求1的权利要求3、6和7相对于附件6也具备新颖性。

       综上所述，权利要求10和13相对于附件4具备新颖性，权利要求10相对于附件5具备新颖性，权利要求1、3、6和7相对于附件6具备新颖性。由此，请求人主张的权利要求1、3、6、7、10和13因不具备新颖性而不具备创造性的理由也不成立。

关于创造性

       专利法第22条第3款规定，创造性，是指同申请日以前已有的技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步。

       发明构思是发明人为解决技术问题而提出的技术改进思路，在评判权利要求创造性的过程中，通常需要结合发明构思，从整体角度对本专利和现有技术中的技术方案进行对比和分析，判断现有技术是否给出了引入区别技术特征以解决相应技术问题的技术启示。

       权利要求1请求保护一种用于产生具有第一标签和第二标签序列的DNA片段的文库的方法，其中包括提供包含高活性Tn5转座酶和含Tn5转座子末端序列及第一或第二标签序列的第一多核苷酸和第二多核苷酸的多种转座体复合物，将所述靶DNA与转座子复合物在其中所述靶DNA被断裂成双链DNA片段并且所述第一多核苷酸或第二多核苷酸之一连接至所述DNA片段的每个末端的条件下孵育以产生具有第一和第二标签序列的DNA片段的文库。根据说明书的描述，本专利的发明构思是通过转座反应将带标签序列和转座子末端序列的核苷酸序列转移到因转座反应而被切割的DNA片段的末端，以产生带标签的DNA片段文库用于下一代的大规模测序，其中所述标签序列是独立于转座子末端序列的非靶DNA序列，其通过与转座子末端序列转移链的5′端结合，利用转座酶的转座反应，连接到断裂的双链DNA片段的5′端，然后在DNA聚合酶的作用下产生5′和3′加标签的单链DNA片段，以满足大规模DNA平行测序模板的要求（参见本专利说明书第0012、0017、0020-0023段）。

       附件6公开了一种对DNA模板进行测序的体外方法，该方法先将更大的DNA区段碎片成片段，然后再通过使用一个或几个测序引物对整个区段进行测序，其中具体包括：在待测DNA以及一个或多个转座子存在的情况下进行转座反应和扩增反应。其中实施方案A和B用的是同一种转座子，实施方案C用的是具有不同末端的转座子，从而能够设计用于两个末端的选择性引物。实施例3是对实施方案C的具体说明，实施例3步骤a）的转座反应包括：提供pUC19质粒作为靶DNA，使用具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:17所示序列的两种不同的双链转座子DNA（供体A和供体B）的混合物进行转座反应，所述转座子DNA能与MuA转座酶形成功能性转座子复合物，将上述反应混合物在合适的条件下孵育，从而两个或更多个转座子命中同一质粒分子，以产生不同的随机大小的产物，步骤b）涉及通过凝胶电泳分离扩增产物，步骤c）通过选择性PCR反应进行扩增和测序。选择性PCR扩增反应中一个引物与第一转座子末端互补，第二引物与第二转座子末端互补，所述选择性通过将选择性核苷酸附加到仅一个引物的末端来完成，具体地，引物3和4与具有0或1个选择性核苷酸的供体A的连接末端（即3′端）互补，引物9和10与不具有选择性核苷酸的供体B的非连接末端（即5′端）互补。从附件6公开的整体内容可以看出，附件6的发明构思在于在转座反应后，通过使用选择性引物进行选择性扩增以实现最终的测序目的，其中转座反应仅是在靶DNA的两端引入不同的转座子末端以作为选择性引物扩增的两个不同位点，在转座反应中，供体A和供体B 各自都是一个完整的转座子，作为整体参与转座反应。

请求人认为：

       附件6的实施例3的供体A和供体B各自包括能够与MuA转座酶形成功能性转座复合物的序列以及扩增引物结合位点的额外序列，所述额外序列在转座反应中连接至靶DNA，因此供体A和B相当于权利要求1中的含转座子末端序列和第一标签序列的第一多核苷酸和含转座子末端序列和第二标签序列的第二多核苷酸，因此权利要求1与附件6实施例3的区别在于权利要求1使用的是高活性Tn5转座酶和Tn5型转座子末端序列，而附件6实施例3的转座体复合物中使用的是MuA和MuA酶识别序列，但附件6和附件7都给出了使用高活性Tn5转座酶和Tn5型转座子末端序列的教导，因此权利要求1相对于附件6和7的结合不具备创造性。

合议组认为：

       判断权利要求1相对于附件6和7是否具有创造性的关键在于确定附件6中的供体A和B中的扩增引物结合位点能否相当于权利要求1中的标签序列。

      首先，如上所述，从附件6的整体发明构思来看，其提供的是一种具体的测序方法，通过转座反应得到片段的目的只是为了进行后续的选择性扩增，以实现进一步的测序，附件6中完全没有提到构建能够适用于下一代测序方法的DNA文库的相关内容，附件6的发明人并未意识到要在转座子末端另外添加DNA序列作为实现特定寻址目的的标签，以用于后续的大规模测序等多种其他用途，其中供体A和B中引物识别位点对应的区域是相应转座子的一部分，并不是另外添加上去作为标签的其他DNA序列；其次，附件6实施例3提供了双链转座子DNA-供体A和B非转移链的具体序列（SEQ ID NO：1和17）,具体分析供体A的序列可以确定，引物3的5′端起始于Mu转座酶的末端结合序列R1中，3′端终止于Mu的切割位点，引物3序列对应于Savilahti等（1995）图2A中Mu末端切割点右侧的序列。本领域技术人员已知Mu末端切割点右侧的序列(涵盖R1和R2)在功能上是一个整体，用于实现Mu转座。因此所述扩增引物的结合位点实质是转座子末端序列3′端的延伸，并不相当于权利要求1中连接在转座子末端序列5′端的标签序列。对于供体B的序列，附件6记载了供体B来源于大肠杆菌的噬菌体Mu，并列出了具体的碱基序列，但仅提到引物9和10与供体B的非连接端互补。据此可以清楚得知引物9、10对应于供体B转移链中非连接端的Mu末端结合位点侧翼的序列。虽然供体B的转移链的5′端客观上确实存在与引物结合的部分，但供体B在反应过程中主要作为转座子，整体参与转座反应，在整个扩增反应过程中，与供体A连接端互补的选择性引物和与供体B非连接端互补的确定性引物的配合使用才能实现最终的选择性扩增，即引物需要分别靶向供体A和供体B的不同末端，因此，附件6的发明人并未意识到同时在供体A和供体B非连接端（即相同的一端）设置标签的作用，即附件6并未意识到这些非连接端可作为本发明的标签序列。根据附件6中所描述的供体A和B的具体序列以及在转座中将所述序列互补链的3′末端与靶DNA连接，可知其转座的目的仅是将不同的转座子末端序列引入靶DNA的末端，即便如请求人所述转座子DNA含有与MuA转座酶形成功能性转座复合物所需序列之外的额外序列，但根据其在供体A和B中的不同设置位置可知，其是通过利用涵盖上述已知的附加核苷酸序列的选择性引物的选择性扩增来获得用于测序的不同模板。本领域技术人员基于解决附件6的技术问题的需要根本不会想到在供体A和供体B非连接端（即相同的5′端）设置标签。而本专利是在转座子DNA的设计中，将标签序列连接到转座子末端序列转移链的5′端，使得经过转座反应在双链靶DNA片段的5′端根据需要连接特定功能的标签，例如扩增标签等。可见，其也不同于本专利中通过转座反应直接在靶DNA序列两端添加标签序列。所以附件6未公开权利要求1中的含转座子末端序列和第一标签序列的第一多核苷酸和含转座子末端序列和第二标签序列的第二多核苷酸。

       附件7涉及采用经修饰的Tn5转座酶的体外转座系统，包含细菌转座子Tn5的经适当修饰的转座酶制备物、包括可转座原件的DNA供体分子；附件8涉及用于填充缺口的DNA聚合酶（参见附件8的译文）；附件9涉及利用接合夹板寡核苷酸和连接酶将捕获探针的5′末端和3′末端连接在一起（参见附件9的译文）；附件10涉及链置换扩增技术的影响因素研究；附件11涉及滚换扩增原理及其在医药领域的应用；附件12涉及环介导等温基因扩增技术及其应用研究进展，其中都未公开或教导权利要求1中的含转座子末端序列和第一标签序列的第一多核苷酸和含转座子末端序列和第二标签序列的第二多核苷酸。请求人关于权利要求1、10相对于附件6和7的结合不具备创造性的理由不成立，相应的从属权利要求2-9、11-16不具备创造性的理由也不成立。

决定

      维持第200980152461.8号发明专利权有效。

当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人作为第三人参加诉讼。