斑马鱼在药物毒理学评估中应用及机制的研究进展

摘  要： 与其他哺乳动物相比，斑马鱼具有繁殖能力强、繁殖量大、生命周期短、养殖费用低、身体透明等特点。主要从心血管毒性、肝脏毒性、肾脏毒性、神经毒性、脾脏毒性和急性毒性 6 个方面进行归纳总结，结果发现斑马鱼的多个器官在形态、基因表达及生理特性方面均与哺乳动物高度相似，已被广泛应用于药物的毒性物质筛选研究。药物对斑马鱼毒性研究主要集中在死亡率和畸形率增加，心、肝、肾、脾等脏器形态、表型改变并伴有水肿及神经毒性等方面；其毒性机制主要涉及影响器官中细胞凋亡（ p53 通路）、炎症（ NF-κB 通路、白介素）或影响该器官功能蛋白、酶或 mRNA ，如丙氨酸氨基转移酶（ ALT ）、天冬氨酸氨基转移酶（ AST ）、乙酰胆碱酯酶（ AChE ）、微球蛋白前体（ mbp ）和 α 微管蛋白（ α tubulin ）等。斑马鱼模型可作为一种评估药物安全性与毒性最为高效、快速、便捷的方法，阐明药物的毒性作用及其多组分多靶点的毒性作用机制，可为药物毒理学中的毒性评估提供新的思路。

提高药物早期毒性预测的可靠性和灵敏度已成为新药开发行业的迫切需求，而斑马鱼具有高通量的评价、检测和筛选药物毒性作用的独特优势，其作为药物毒性与安全性评价的实验动物受到医药学界越来越多的重视，已逐渐成为药物研发过程中毒性评价和安全性评价的重要工具 ^[12] 。结合国内外文献报道，本文综述了斑马鱼作为新兴模式生物在药物毒理学评价方面的研究进展，主要从药物心血管毒性、肝脏毒性、肾脏毒性、神经毒性、脾脏毒性和急性毒性 6 个方面及多组分多靶点的毒性作用机制进行归纳总结，以期为斑马鱼在药物毒理学中的毒性评估提供新的思路。

1 评估药物的心血管毒性

1.1 斑马鱼评价心血管毒性的优势

心血管毒性是药物研发的主要限制因素 ^[13] 。斑马鱼的心血管系统是由心房、心室、静脉窦和动脉球串联而成 ^[14] ，其心脏发育是一个迅速但复杂的过程，胚胎在受精后 5 h （ hours postfertilization ， hpf ）时心脏前体细胞成型， 22 hpf 时心脏开始出现收缩动作， 48 hpf 时功能性瓣膜逐渐形成，心率趋于稳定， 72 hpf 时完成胚胎期心脏的发育。与此同时，斑马鱼在 24 hpf 时尾部由蜷缩状态开始伸展，节间血管开始生长，到 48 hpf 时节间血管基本发育完全。有研究报道，斑马鱼心脏发育的形态、基因、生理特性以及血管生成过程均与哺乳动物相似 ^[15-16] ，可通过光学显微镜对其心脏、血管和血液流动状态进行全程的监视，用于探究药物对斑马鱼的心血管毒性作用，为筛选药物的心血管毒性作用提供有效依据 ^[17] 。目前，在血管系统、血液、内皮细胞和心脏中表达荧光蛋白的转基因系斑马鱼的可用性也有助 于精确和准确地评价药物对心血管系统的影响 ^[18] 。 可见斑马鱼的上述优势使其成为筛选药物心血管毒性的重要生物模型。

1.2 药物对心血管毒性的影响

传统中药中提取分离出的很多单体化合物具有明显的药理活性，可以作为新药研发过程中的先导化合物，但是由于它们可能具有一些潜在的心血管毒性作用而限制了其临床应用。何俊霖等 ^[19] 以 2 、 4 、 8 、 10 μg/mL 异甘草素处理正常斑马鱼胚胎 10 、 24 h ，结果显示异甘草素质量浓度高于 2 μg/mL 可抑制斑马鱼胚胎血管生成，达 8 μg/mL 时，胚胎开始出现轻微血液瘀滞现象，且完全抑制尾部静脉血管的生成。异甘草素处理 12 h 后，胚胎心率随异甘草素质量浓度的升高而呈降低的趋势，当质量浓度达到 10 μg/mL 时，对胚胎心率有持续性的抑制作用和诱发心脏畸形的作用，导致胚胎心包和卵黄囊肿大。这表明高剂量的异甘草素对斑马鱼的胚胎发育有较强的毒性作用。赵慧等 ^[20] 建立阿霉素诱导的转基因 Tg （ cmlc2 ∶ EGFP ）系心脏特异表达绿色荧光斑马鱼心肌损伤模型，结果显示阿霉素 30 、 40 μg/mL 干预 24 、 48 h 后，胚胎生存率显著降低，其活动受到抑制，心房、心室变大，出现不同程度的心包水肿，且动脉球间距显著增大；病理染色结果也提示给药后斑马鱼心脏明显变大，且结构紊乱，有红细胞溢出等。此外，氯化钡、广藿香、诺氟沙星、京大戟等对斑马鱼心血管发育生长也具有一定影响 ^[21-27] 。斑马鱼在药物心血管毒性中的研究见表 1 。

1.3 药物对斑马鱼心血管毒性的作用机制

赵慧等 ^[20] 通过阿霉素建立心肌损伤模型，通过 DAPI 和 TUNEL 染色发现阿霉素 40 μg/mL 组斑马鱼心脏明显变大，细胞数目减少且较稀疏，细胞核增大，凋亡细胞增多，且阿霉素对斑马鱼胚胎的心肌损伤作用呈时间和浓度相关性。表明阿霉素诱导的斑马鱼心肌损伤模型是可靠的，且其机制可能与增加心肌细胞凋亡有关。王冬梅等 ^[24] 观察了 0 、 10 、 20 、 40 μmol/L 诺氟沙星对斑马鱼胚胎不同发育时期脊柱弯曲、心包囊肿、卵黄囊肿和死亡率等毒性作用，结果显示随着诺氟沙星暴露浓度的增大，胚胎的发育延迟，孵化时间延长，胚胎死亡率增加；且暴露于不同浓度诺氟沙星的斑马鱼胚胎中 TGF-β1 基因表达随发育时间延长而增加趋势减缓。提示诺氟沙星的心脏毒性机制与 TGF-β1 基因相关。

2 评估药物的肝脏毒性

2.1 斑马鱼评估肝脏毒性的优势

药物性肝损伤已逐渐变成临床医学和新药研发中的一个重大挑战。因此，寻找新的模型来预测潜在治疗药物是否导致药物性肝损伤迫在眉睫。研究表明，斑马鱼肝脏在 28 hpf 时开始发芽，在 72 hpf 时被血液灌流并具有生理功能，在肝脏的形成过程中，其通体透明，易于观察 ^[28-30] 。有研究显示，斑马鱼的器官、生长因子和基因的表达、肝细胞组成、功能、信号和对损伤的反应等方面与高等脊椎动物有很多相似之处 ^[31-32] ，使其成为检测药物肝毒性和研究其肝毒性机制的重要手段。将胚胎或幼鱼暴露，通过观察肝脏表型、特殊染色处理或生化指标检测等手段，可直接或间接探究药物对斑马鱼肝脏的影响。此外，采用肝脏荧光转基因斑马鱼，如 Tg （ fabp10 ∶ EGFP ）、 Tg （ zlyz ∶ EGFP ）等作为模型，是评价肝脏毒性的又一手段，通过斑马鱼整体图像的分析技术，对肝脏面积大小和肝脏荧光强度进行综合定量分析，快速、系统的评价药物的肝脏毒性作用 ^[33] 。因此，斑马鱼作为药物肝脏毒性筛选的模式生物，也具有重要的意义。

2.2 药物对肝脏毒性的影响

段亚辉等 ^[34] 采用斑马鱼模型比较款冬花、叶的肝脏毒性，观察款冬花和叶给药后 3 d 对健康 AB 系及转基因系斑马鱼肝、肾形态、肝脏的荧光面积、肝脏丙氨酸氨基转移酶（ alanineaminotransferase ， ALT ）、天冬氨酸氨基转移酶（ aspartate aminotransferase ， AST ），结果显示款冬花和叶对斑马鱼肝脏生化指标无显著影响，但款冬花 1.5mg/mL 组斑马鱼肝脏荧光面积减小，提示款冬花对肝脏产生一定的毒性，款冬叶未表现出明显的肝毒性。全云云等 ^[35] 首次用肝脏荧光转基因斑马鱼 Tg （ lfabp ∶ EGFP ）对何首乌中的 18 种成分进行了肝脏毒性研究，检测斑马鱼肝脏表型、面积、荧光强度、肝体比和病理情况等指标，结果发现，何首乌肝毒性的物质基础可能是由蒽醌类化合物介导，且以结合蒽醌为主，同时发现芦荟大黄素和芦荟大黄素 -8- O - 葡萄糖苷对斑马鱼体内 ALT 、 AST 、谷胱甘肽（ glutathione ， GSH ） 和总胆红素（ total bilirubin ， TBIL ）水平、肝脏组织病理等影响较大，可能是肝毒性主要物质基础 ^[36] 。 此外，吡嗪酰胺、香加皮、芫花等对斑马鱼肝脏毒性作用，也取得了一定的成果 ^[37-40] 。见表 2 。

2.3 药物对斑马鱼肝脏毒性的作用机制

付晓春等 ^[37] 考察雷公藤多苷对斑马鱼肝脏损伤的表型及对肝细胞凋亡的影响，结果显示雷公藤多苷 383 、 417 g/mL 时给药 24 ～ 48 h 显著性增加斑马鱼的卵黄囊面积、增加肝脏面积和延迟卵黄囊的吸收。雷公藤多苷 42.5 、 128 、 383 g/mL 连续给药 48 h 后可观察到斑马鱼肝细胞凋亡明显增加， Caspase-3 蛋白活性增加，促凋亡蛋白 Bax 的表达量显著增加，但 Caspase-9 蛋白的活性以及 Bcl-2 基因的表达未见明显改变。提示雷公藤多苷的肝毒性机制与 Caspase-3 蛋白激活，促肝细胞过度凋亡有关。 Quan 等 ^[41] 用 Tg （ fabp ∶ EGFP ）型斑马鱼研究芦荟大黄素的肝毒性作用及其潜在的毒性机制，结果发现芦荟大黄素的肝毒性机制与核因子 κB （ nuclearfactor kappa-B ， NF-κB ）蛋白的炎症通路和 p53 基因的凋亡通路的激活有关。

3 评估药物的肾脏毒性

3.1 斑马鱼评估肾脏毒性的优势

肾脏是人和高等动物主要的排泄器官，主要滤过血液中的杂质、维持体液和电解质的平衡、药物代谢等，因此肾脏容易成为药物毒性物质累积并引发急性损伤的靶器官。斑马鱼胚胎在 24 hpf 内形成，具有由 2 个肾单位组成的解剖学上简单的肾上腺，其肾单位结构、功能和分子组成与人类肾脏高度相似 ^[42-43] ，具有排泄水和维持渗透的功能 ^[44] ，故近年来在肾脏发育和肾脏疾病研究中的应用进展有了巨大的增长 ^[45-46] 。渗透压调节紊乱易损伤斑马鱼肾脏，使其肾脏出现不同程度的水肿、组织形态改变等，可通过显微观察或组织病理切片观察肾脏异常，还可通过荧光显微镜观察转基因斑马鱼肾脏的荧光面积，评价肾脏损伤情况。快速、高通量筛选是斑马鱼作为肾脏毒性研究工具的重要优势。

3.2 药物对肾脏毒性的影响

Hentschel 等 ^[47] 利用肾毒性药物第 1 次成功地构建了斑马鱼急性肾损伤模型，在 50 、 72hpf 的斑马鱼胚胎心脏静脉窦内注射庆大霉素或顺铂引起严重的肾小管重吸收功能障碍。梁锦锋等 ^[48] 利用斑马鱼模型评价注射用盐酸万古霉素和厄贝沙坦片的肾毒性，结果发现万古霉素在注射剂量为 16.4 ng/ 尾时，斑马鱼发育正常，未见明显的毒性，注射剂量在 54.7 ～ 273 ng/ 尾，有明显的肾毒性。厄贝沙坦在 8.3 ～ 91μg/mL 时，斑马鱼肾脏均发育正常，未见肾毒性。此外，也有关于中药对斑马鱼肾毒性的相关研究。研究表明，款冬花和款冬叶中含有毒性物质吡咯里西丁生物碱 ^[49] 。段亚辉等 ^[34] 通过款冬花和叶给药后 3 d 对健康 AB 系及转基因系斑马鱼的肾形态、表型和培养液蛋白量水平进行观察，评价药物肾脏毒性，结果显示各给药组斑马鱼形态无明显的改变，全身 或局部未出现水肿，培养液上清中也无蛋白，提示斑马鱼肾小球滤过功能正常，药物对斑马鱼肾脏无明显毒性。说明斑马鱼可作为药物肾毒性的筛选工具。

3.3 药物对斑马鱼肾脏毒性的作用机制

Gorgulho 等 ^[50] 采用 10% 庆大霉素、扑热息痛和替诺福韦对斑马鱼幼鱼肾脏的影响进行观察，结果显示庆大霉素和扑热息痛降低肾清除率，扑热息痛和替诺福韦扩大近端小管，其肾毒性机制与线粒体改变有关，包括变形、线粒体肿胀、嵴断裂和（或）基质颗粒丢失。王雪等 ^[51] 采用 Tg （ wt1b ∶ GFP ）转基因斑马鱼研究马兜铃酸的肾毒性，发现马兜铃酸 40 ～ 80 μmol/L 处理后斑马鱼的肾出现肾小球囊性膨胀、结构疏松、前肾管上皮细胞细胞排列松散、紊乱及管腔扩张样改变， qPCR 检测发现 20 μmol/L 马兜铃酸处理 24 h 后 nephrin 蛋白（ nephrin 表达于肾小球足细胞，其与裂孔隔膜的形成相关）表达显著降低，表明马兜铃酸诱发肾损伤的原因可能是肾小球足细胞的功能变化。以上结果说明斑马鱼是研究药物对于肾毒性作用的良好模型，并可以利用斑马鱼模型进一步研究药物肾毒性的相关研究。

4 评估药物的神经毒性

4.1 斑马鱼评估神经毒性的优势

随着人口老龄化，神经退行性疾病的发生率也逐渐增加。近些年，研究人员发现斑马鱼作为模式生物进行药物神经毒性研究评估较其他模型生物有不可比拟的优势。斑马鱼的中枢神经系统排列、神经形成的过程和具体的机制以及对药物的反应与其他脊椎动物相似，且很多神经退行性疾病蛋白与人类同源 ^[52] 。尽管斑马鱼的神经系统简单，但可以支配复杂的生理活动，还能够对其进行运动、学习和记忆等相关评价 ^[53] 。因此，斑马鱼作为脊椎动物模型被广泛应用于筛选神经系统疾病药物和某些药物神经毒性的研究评估 ^[54-55] 。模式动物斑马鱼的死亡率、孵化率、半数致死浓度（ lethal concentration 50 ， LC ₅₀ ）、斑马鱼幼鱼总移动距离和平均速度是评价药物神经毒性的主要指标。

4.2 药物对神经毒性的影响

二甲基亚砜（ dimethyl sulfoxide ， DMSO ）被称为“万能溶剂”，在斑马鱼实验中广泛被用来助溶某些实验试剂 ^[56] ，但目前关于 DMSO 在斑马鱼体内的神经毒性报道较少。甘津凡等 ^[57] 用 0.5% 、 0.8% 、 2.5% DMSO 对 Tg （ Vmat2 ∶ GFP ）斑马鱼胚胎及多巴胺能神经元发育的影响进行了研究，其结果发现 DMSO 会引起斑马鱼神经毒性，造成间脑多巴胺能神经元丢失及细胞增殖减少，导致胚胎发育障碍。尚楠等 ^[58] 将 6 hpf 的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度氯丙嗪和丙戊酸钠中，结果显示氯丙嗪质量浓度＞ 4.0 mg/L 、 丙戊酸钠质量浓度＞ 2.0 mg/L 可引起斑马鱼胚胎出现浓度相关性死亡；氯丙嗪和丙戊酸钠质量浓度达到 2.0 mg/L 时可显著降低斑马鱼幼鱼总移动距离和 平均速度，且丙戊酸钠毒性大于氯丙嗪。曹建斌等 ^[59] 观察丙泊酚 5 、 10 、 20 μg/mL 对斑马鱼胚胎运动神经元发育的影响，结果显示丙泊酚 5 μg/mL 组胚胎整体形态发育正常，但运动神经元发育受到抑制，丙泊酚 10 、 20 μg/mL 组胚胎发育停滞在原肠胚时期。提示丙泊酚暴露可抑制斑马鱼运动神经元的发育。刘静等 ^[60] 研究牛黄镇惊丸对斑马鱼胚胎发育的影响，结果显示质量浓度低于 200 μg/mL 时，未见胚胎发育异常。质量浓度高于 200 μg/mL 时，胚胎头眼发育较小，瞳孔无色；心脏畸形、心率较弱、血流受阻；尾干扭曲，卵黄囊延伸结构变粗，脊索变细等。说明牛黄镇惊丸质量浓度大于 200 μg/mL 时对斑马鱼胚胎的神经系统、心血管系统和骨骼等发育均有影响。

4.3 药物对斑马鱼神经毒性的作用机制

王翀昊等 ^[61] 以斑马鱼为动物模型研究乌头碱 0.1 、 0.5 、 1 、 10 、 100 μmol/mL 的神经毒性并初步探索其神经毒性的致病机制，结果发现乌头碱浓度大于 0.5μmol/mL 时可呈剂量相关性的显著性降低斑马鱼游泳活力、幼鱼的肌节长度，抑制 Rohon- Beard 神经元的生理性凋亡，推测其神经毒性与抑制乙酰胆碱酯酶活性有关。但有研究认为，药物的神经毒性机制与提高乙酰胆碱酯酶（ acetyl cholinesterase ， AChE ）活力有关。朱璧然等 ^[62] 研究氯硝柳胺 5 、 10 、 20 、 40 、 80 μg/L 对斑马鱼幼鱼的神经毒性，结果显示氯硝柳胺 40 、 80 μg/L 处理幼鱼存活率降低、畸形率增加、运动速度降低，且幼鱼微球蛋白前体（ microglobulinprecursor ， mbp ）和 α 微球蛋白 mRNA 表达降低、 AChE 活力增加。顾杰等 ^[63] 采用幼鱼染毒、运动行为学测试和胚胎整条原位杂交等实验以及荧光定量 PCR 手段，来研究双酚 AP （ bisphenol AP ， BPAP ）和双酚 AF （ bisphenol AF ， BPAF ）对斑马鱼早期神经发育和行为的影响，发现 BPAP 和 BPAF 可扰乱斑马鱼运动轨迹，降低平均运动速度和移动距离，使其出现呆滞现象，推测其神经毒性机制与抑制斑马鱼神经发育关键基因 mbp 和突触蛋白基因（ synapsin ΙΙa ， syn2a ）的表达有关。王雪等 ^[64] 研究冈田酸 0.05 、 0.10 、 0.20 μmol/L 对斑马鱼幼鱼神经行为功能的影响，结果显示 0.05 、 0.10 μmol/L 冈田酸处理后幼鱼存活率、游动轨迹无明显差异。但 0.20 μmol/L 冈田酸处理后幼鱼存活率、游动活力、游动距离明显降低，呆滞时间明显延长，且幼鱼体内蛋白磷酸酶 2A （ proteinphosphatase 2A ， PP2A ）表达水平明显下调， α7 烟碱型乙酰胆碱受体（ α7 nicotinic acetylcholinereceptor ， α7-nAChR ）基因表达水平则无明显改变。说明冈田酸的神经毒性与 PP2A 基因相关。

5 评估药物的脾脏毒性

脾脏是斑马鱼重要的免疫器官，主要起调控免 疫作用，在对抗外来抗原方面至关重要。郑美娜等 ^[65] 探索香泽兰总黄酮对斑马鱼脾脏显微组织结构的毒性作用结果发现，随着香泽兰总黄酮水触媒染毒浓度的增加，斑马鱼脾脏显微组织结构出现了不同程度的病变，主要表现含铁血黄素沉着增多，脾窦扩张，脾脏内淋巴细胞增多，血细胞核浓缩、溶解，甚至导致脾脏坏死。说明模式生物斑马鱼是可以用来作为药物脾脏毒性研究评估的实验模型。

6 评估药物的急性毒性

6.1 斑马鱼评估药物急性毒性的优势

安全性和有效性是药物的两大基本属性，而我国传统中药，成分复杂、配伍多样，为避免临床使用中的不良反应，对药物进行临床前毒性评价和安全性评估显得尤为重要。急性毒性实验是评价药物安全性的主要指标，对阐明药物的毒性作用和探索其毒性靶器官具有重大意义 ^[66] 。与其他模型动物相比，斑马鱼具有发育快、易获取、易观察、易检测等显著的优势，其胚胎也被广泛应用于药物早期急性毒性研究评估。在斑马鱼急性毒性试验中，常选用 LC ₅₀ 来表示该药物的急性毒性大小。

6.2 药物对急性毒性的影响

陈宏降等