今天这篇文章挺有意思，讲的是肿瘤细胞在微环境中与巨噬细胞的互作，由于肿瘤细胞的p53的缺失，导致了微环境中巨噬细胞的M2极化以及对T细胞产生的影响。这篇文章是中国科学技术大学第一附属医院的博士生和博士后，发表在25.5的Cell大子刊Immunity上的文章，这篇文章层层推进的过程还真挺有意思的：
他们首先使用CRISPR系统，做了四种突变驱动肝癌的模型。这里他们做两种带有p53突变的：Trp53突变+Pten突变，和Trp53突变+Kras突变；另外两种不带p53突变的作为对照：Ctnnb1突变+Pten突变，和Kras突变+Pten突变（这里的Ctnnb1其实就是β-Catenin，也就是Wnt信号通路的关键，Pten则是位于p53的一个下游蛋白，KRas是Ras信号通路中的关键蛋白，这几种突变并不会对p53功能产生多大影响，不清楚的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的这几个信号通路复习下）。结果发现，含有Trp53突变（小鼠中的Trp53就是人体的p53）中的细胞因子IL34表达明显升高：
而通过单细胞测序结果分析发现，高表达IL34的细胞，是具有一定肿瘤干性的CSC（肿瘤干细胞）。那么IL34是否是p53缺失的肿瘤细胞发育和进展的关键呢？他们发现过表达IL34，可以显著增强p53野生型的肿瘤进展，而在p53突变的肿瘤中，敲除了IL34则能缓解肿瘤进展（这其实就是在假设提出后，通过柯霍氏法则，进行了进一步的验证，通过分别敲除和过表达IL34，来确定其对于p53缺失与否造成肿瘤进展的重要性，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《轻松的文献导读》）。那么p53的表达对于IL34的表达又有什么影响呢？他们通过p53抑制剂以及敲除p53后，分析发现，p53缺失可以有效促进IL34的表达。而p53作为转录因子，可以直接结合基因的启动子，于是他们分段克隆了IL34的启动子接Luciferase，然后分析p53过表达后Luciferase的荧光情况。结果发现p53过表达，可以阻遏IL34的转录：
那么研究推进到这里，已经说明了p53缺失会导致IL34的表达增强，而IL34作为一种细胞因子，应该会影响肿瘤细胞微环境中免疫细胞的活动。于是他们就迭代了假设，假设IL34会影响TME（肿瘤微环境）中免疫细胞的变化（这就是通过已有的结果，进行了合理的推断，在推断的过程中迭代了假设，通过这种假设的迭代，推进课题，不清楚假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。那么要怎么样来分析这样的微环境变化呢？他们就采用了空间转录组分析了p53突变后，肿瘤浸润的免疫细胞变化。通过分析发现，IL34可以诱导促瘤泡沫状巨噬细胞，在p53失活的CSCs附近浸润积累，而浸润的这些巨噬细胞，则展现出M2极化的特征，也就是抗炎性的特征：
同时，这些浸润在CSCs周围的巨噬细胞，还展现出更多的脂滴累积。这也就让他们提出了进一步的假设，假设IL34诱导巨噬细胞摄取的这些脂肪酸，可能是巨噬细胞产生M2极化的关键。通过二代测序发现，IL34可以促进巨噬细胞表达CD36，这是一种细胞膜上的长链脂肪酸高亲和力输入蛋白，而CD36的表达可能是IL34刺激后，通过PPARγ转录激活的。他们使用了PPARγ的抑制剂，证实了PPARγ阻断，的确可以抑制IL34诱导的CD36表达。二代测序的结果还显示了IL34刺激后，巨噬细胞的FAO（脂肪酸氧化）也产生了明显的变化。Seahorse实验分析显示（这里他们做的是OCR，也就是耗氧率分析，这个在《信号通路是什么鬼？》系列的铜死亡那几章里，也有过介绍，可以回去看看），在IL34刺激后会增加巨噬细胞的耗氧量，并且在用FAO的关键酶CPT1抑制剂处理细胞后，这种耗氧率增加被阻断。而实验证明，FAO的增强及耗氧率的增加，又与巨噬细胞的M2极化密切相关。也就是说IL34很可能是通过CD36促进脂肪酸摄取，并通过FAO的代谢重编程，诱导了巨噬细胞的M2极化：
那单独的IL34对于巨噬细胞的功能已经验证了，接下去就要说明p53缺失的肿瘤细胞，是否是通过IL34-CD36这个轴，影响了巨噬细胞的极化了。他们通过共培养，来分析了p53突变的肿瘤细胞和巨噬细胞之间的Crosstalk。p53缺失的肿瘤细胞分泌的IL34，可以促进巨噬细胞的CD36以及FAO关键酶CPT1的表达。而p53及IL34双缺失的肿瘤，则无法激活巨噬细胞的FAO（实际上这里的验证，如果更为严谨一点的话，突变掉IL34启动子上p53的结合位点，既然之前已经通过Luciferase验证过p53结合的关键位置，这里就应该尽量避免直接敲除IL34，避免产生肯定后件的逻辑谬误，不清楚肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。总的来说，他们就通过这些共培养实验，验证了p53缺失的肿瘤细胞，通过IL34与巨噬细胞直接的Crosstalk：
微环境中，其实不止是巨噬细胞，他们又进一步分析了p53缺失后，引发的T细胞的变化。结果发现，p53缺失后，T细胞展现出了耗竭标志物的增加，也就是CD8+ T细胞增殖和IFNγ产生的能力受到了抑制。而共培养后发现，敲减了巨噬细胞中CD36后，也可以消除T细胞增殖和IFN-γ产生的抑制。也就是说，IL34-CD36轴诱导的TAM（肿瘤相关巨噬细胞），通过抑制Trp53缺失的肿瘤细胞中浸润T细胞的抗肿瘤免疫，起到免疫抑制的作用：
而进一步的体内实验验证，抗IL34和抗CD36抗体，可以有效抑制p53缺失的肝癌进展。也就是说，阻断IL34-CD36信号轴，可以作为p53突变癌症的潜在免疫疗法：
最后就形成了这样的示意图，p53可以抑制IL34转录，而p53突变缺失后，肿瘤细胞的IL34表达增多。IL34可以刺激巨噬细胞，通过PPARγ激活CD36表达，CD36通过脂质转运，促进了巨噬细胞的FAO，引发了代谢重编程，而这也最终导致了巨噬细胞的M2极化。M2极化的巨噬细胞，会通过抑制CD8+ T细胞，导致CD8+ T细胞耗竭，阻碍CD8+ T细胞对肿瘤的抑制，最终起到了免疫抑制的作用：
这篇文章推进的过程还是很有意思的，从p53的突变缺失，引出了IL34。而通过IL34影响的巨噬细胞，发现了巨噬细胞的FAO代谢重编程，以及M2极化变化。有通过M2巨噬细胞，挖出了T细胞的耗竭引发的免疫抑制。这一层层的推进，其实都是通过假设以及假设的迭代完成的（在科研推理的过程中，假设和假设的迭代，是推进科研进展必不可少的推动力，不清楚科研课题推进过程中的假设和假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列），推理的过程也很有意思。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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