生产双链RNA工程菌的研究进展

农业是百业之基，粮食是立足之本，粮食安全是人类生存和发展的首要问题。在未来几十年里，随着全球人口的持续增长，对农产品的需求将不断上升。病虫害是影响作物产量和品质的重要因素，据调查，全球每年因病虫害导致的作物产量损失在20%–40%之间，使用化学农药可以挽回至少30%的产量损失 ^[1] 。但化学农药的过度使用造成病害防治效果下降、农药残留超标以及食品安全等问题，给作物生产带来了极大挑战。随着社会的不断进步，人们对健康和环保的关注逐渐增加，因此研发绿色环保的新型农药已成为未来农药领域发展的主要趋势。

双链RNA农药可以通过外源施加靶向特定病原菌或害虫特定基因的dsRNA来启动RNAi反应，从而抑制病原菌或害虫，实现对特定病虫害的控制；相对于化学农药，双链RNA农药具有诸多优势；首先，dsRNA具有较强的特异性和高效的基因沉默能力且不涉及转基因技术；其次，根据靶点的设计，dsRNA可抑制病毒、细菌和真菌的生长从而对其引起的病害起到防治效果；另外，dsRNA能够穿越细胞膜，在体内实现长距离传递；最后，dsRNA在环境中容易降解，是一种环境友好型的农药。基于上述优点，双链RNA农药有望成为化学农药的重要补充或替代品 ^[2] 。

双链RNA农药利用的是RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)，RNAi是一种广泛存在于真核生物当中的同源定向转录后调控系统，该系统依赖序列互补配对原则特异性地降解mRNA。1990年Fire和Mello发现了RNA干扰技术，并于2006年获得诺贝尔生理或医学奖，目前该技术已被广泛应用于基因功能研究、基因治疗等多个领域 ^[3] 。如图1所示，RNAi的关键组成部分之一是dsRNA，dsRNA进入细胞后，首先被细胞中Ⅲ型核糖核酸酶Dicer 2切割为19–23 bp的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)，其两端分别带有2 bp的黏性末端。siRNA中热稳定性较差的一条链与Argonaute (AGO)、Hsp70/Hsp90、Dicer等蛋白质结合，装配成RISC (RNA induced silencing complex)复合体，该复合体中的AGO蛋白具有4个结构域，N-末端结构域负责解开双链并装载引导链以组装成熟的RISC，PAZ结构域特异性识别ssRNA的3′端，MID结构域结合5′端，一些AGO中的PIWI结构域具有切割功能，该复合体可通过切割或抑制mRNA翻译来下调基因的表达 ^[4-5] ，在mRNA切割过程中产生的核糖核苷酸小片段可以继续与AGO等蛋白结合持续触发RNAi效应。此外，microRNA、short hairpin RNA等小RNA也可以触发RNAi，但将RNAi应用于农业领域时，应用最广泛的是外源添加dsRNA。

目前主要有2种应用dsRNA防治植物病虫害的方法，一种是培育转基因植株，使其表达靶向害虫必需基因的dsRNA。2017年，拜耳集团研发的含有玉米根虫防控性状的玉米种子(Smartstax ^® PRO MON87411)获得了多个国家的 安全证书及种植许可，该作物在表达Cry34Ab1/Cry35Ab1和Cry3Bb1两种苏云金芽孢杆菌( Bacillus thuringiensis , Bt)蛋白的基础上可表达靶向玉米根虫的dsRNA，可增强对玉米根虫的控制 ^[6-7] 。2021年，科迪华农业科技公司利用转基因方法获得了玉米转化体DP23211，能同时表达DvSSJ1 dsRNA和IPD072Aa蛋白，可对 玉米根虫进行有效防治 ^[6-7] 。另一种是利用载体递送或直接喷洒dsRNA以触发RNAi效应 ^[8] 。 这种方法无须构建转基因植株，不具有遗传性，其本质是通过外源添加RNAi途径的底物dsRNA，来特异性地抑制害虫或病毒必需基因的表达，但该方法的实施需要以廉价的方式生产足量的dsRNA。2019年，拜耳集团向美国环境保护署(U.S environmental protection agency, EPA)提交了第一份外源应用的RNA生物农药——BioDirect，该产品是利用RNAi原理，通过外源添加dsRNA进行瓦螨的防治；2023年底Greenlight Biosciences开发的以双链RNA为有效成分的农药Calantha ^TM 被美国EPA批准，用于防治科罗拉多马铃薯甲虫 ^[6-7] 。

目前用 于生产dsRNA的方法主要有3种：第一种是化学合成法，利用核糖核苷酸(nucleoside triphosphate, NTPs)合成2条互补的单链RNA (single stranded RNA, ssRNA)，使互补的单链RNA退火形成dsRNA。目前合成dsRNA的工业成本已低至60美元/g，但受限于合成技术，所得到的dsRNA产品长度较短 ^[9] 。第二种方法是体外转录( in vitro transcription, IVT)，通过RNA聚合酶进行体外合成 ^[10] ，是实验室范围 内合成dsRNA的常规方法，大多数IVT反应使用噬菌体T7 DNA依赖性RNA聚合酶(DNA dependent RNA polymerase, DdRp) ^[11] ，一次反应可产生50–100 μg的dsRNA。MEGAscript™ RNAi试剂盒可以生产dsRNA，10 mg的成本约为3 000美元，其成本仍然较高，并不适用于大规模应用 ^[10] 。 由GreenLight Biosciences开发的无细胞表达体系在dsRNA生产中有着巨大的优势，其成本已低至 0.5美元/g ^[12] 。 第三种是构建优质的微生物细胞工厂用于生产目标dsRNA，目前已有多项研究通过发酵来生产dsRNA，并通过实验验证了所得的dsRNA具备触发RNAi的效果，该方法无需使用酶制剂，具有一定的成本优势，有望成为大规模生产dsRNA最有效和最具成本效益的方法 ^[13] 。通过理性化设计与改造将自然菌株开发为适于dsRNA表达的底盘菌株，有利于实现较低成本下的dsRNA高产。本文主要综述了近期用于生产dsRNA的工程菌株和提高dsRNA产量的研究进展。

图1  RNAi原理示意图

表1  目前用于dsRNA生产的底盘菌

Table 1  Representative chassis during the production of several dsRNAs

1.1 大肠杆菌

大肠杆菌( Escherichia coli )是最重要的模式菌之一，因其遗传信息清晰、遗传操作系统丰富、生长迅速、培养成本低，已被开发为生产多种产物的工程菌株。目前HT115(DE3)、JM109(DE3)、BL21(DE3)等菌株已被开发为底盘细胞用于生产dsRNA ^[24] 。L4440-HT115(DE3)系统是目前实验室中生产dsRNA时使用最广泛的，HT115(DE3) 菌株中编 码核糖核酸酶RNase D和RNase E的基因 rnd 和 rne ， 以及编码dsRNA特异性核酸内切酶RNase Ⅲ的基因 rnc 均被失活，从而使菌 株合成dsRNA的能力得到提高 ^[25] 。Palli团队 ^[26] 利 用HT115(DE3)产生靶向科罗拉多马铃薯甲虫( Leptinostarsa decemlineata )的dsRNA，在喂食甲虫后成功触发RNAi效应导致其显著死亡。Yin等 ^[15] 在JM109(DE3)的基础上，将 rnc 与 lacY 基因突变，其中 lacY 基因编码β-半乳糖苷渗透酶，其缺失可以使细胞受到IPTG更均一水平的调 节和诱导。Ma等 ^[14] 将pET28载体、L4440载体与BL21(DE3)RNase III-、HT115(DE3 )两两组合，结果显示pET28-BL21 (DE3)RNase III-产量最高，可达4.23 μg/L，是pET28-HT115(DE3) 的4.8倍，是常用来生产dsRNA的L4440-HT115 (DE3)系统的3倍。

1.2  谷氨酸棒杆菌

谷氨酸棒杆菌( Corynebacterium glutamicum ) 是生产氨基酸时最常用的菌种之一，最近的研究发现谷氨酸棒杆菌可以产生大量RNA ^[16] 。Hashiro等 ^[27] 以谷氨酸棒状杆菌为底盘细胞生产dsRNA，对生产菌进行酒精或热 处理灭活，使得dsRNA在体内稳定存在，在用含有diap1*-dsRNA的灭活菌体喂食茄二十八星瓢虫( H enosepilachna vigintioctopunctata )后，发现这种预处理后的dsRNA仍具有RNA干扰的效果，使得害虫中 diap1 的表达受到抑制，幼虫的食叶活动减弱。2019年，Hashiro等 ^[17] 在原有谷氨酸棒状杆菌生产系统的基础上进行了优化，使用拷贝数约为300的pVC7N载体以及强启动子F1，此外研究人员设计了靶RNA模型—— U1A*-RNA，同时引入可与之结合的U1A蛋 白，该蛋白的SL-II结构区域可与U1A*-RNA特异性结合从而起到保护作用，最终U1A*-RNA 产量在24 h内可达300 mg/L；随后该团队对此生产平台进一步优化，使用拷贝数约为800的pPK4H1载体、T7噬菌体的RNA聚合酶及终止子，所得工程菌株在0.3 L发酵罐中dsRNA的产量最高可达1.0 g/L，发酵结束时 OD ₆₂₀ 可达160，且结果显示产生的dsRNA数量超过了宿主菌内源性5S rRNAs的数量，在不影响生产效率的基础上可以生产长达1 kb的dsRNA，而使用F1启动子时，仅能产生长度为500 bp的dsRNA。

1.3  丁香假单胞菌

假单胞菌噬菌体(φ6)是一种dsRNA病毒，可以特异性地侵染假单胞菌，其含有的依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)，是dsRNA病毒编码合成基因组必需的酶，可以利用ssRNA作为模板合成dsR NA ^[28] 。Niehl等 ^[18] 开发了一种基于噬菌体φ6及其宿主丁香假单胞菌( Pseudomonas syringae )的dsRNA生产方法 ^[18,29] ； 该工作根据Phi6噬菌体原基因组特点构建了3种 质粒，分别为pLM991、pMS2-9 rep-MP和pLD18-5 rep-MP，它们分别依赖T7启动子转录出经过改造的ф6噬菌体基因组中的L段、M段、S段，其中L段会翻译成带有RdRp活性的原衣壳，M段和S段经过理性改造后转录出带有靶序列的ssRNA，原衣壳包裹3种ssRNA的同时生成互补链，此时即生成了一个完整的假单胞菌噬菌体ф6，可以在丁香假单胞菌中不断扩增下去，而其基因组中的M段和S段即为目标dsRNA产物；该系统可产生   2 600 bp以上的dsRNA，并且可以同时产生   2种序列不同的dsRNA。研究人员利用该系统同时生产了靶向TMV病毒复制酶和运动蛋白的dsRNA，并在100 mL发酵液中提取到700 μg dsRNA，经实验验证，生产的dsRNA可以有效地抑制TMV病毒在植物中的传播 ^[18] 。该工作巧妙地改造了假单胞噬菌体的基因组，利用dsRNA病毒合成自身基因组的工作酶合成目标dsRNA，使dsRNA的产生更偏向于生物学过程，为生物技术和农业病害防控领域提供了创新性的解决方案。

1.4  苏云金芽孢杆菌

苏云金芽孢杆菌( Bacillus thuringiensis )可以在芽孢形成期间表达具有杀虫活性的Cry毒 素，目前已广泛用于防治鳞翅目害虫。Park 等 ^[19] 将苏云金芽孢杆菌改造为dsRNA底盘菌，生产了具有抑制囊状幼虫病毒(sacbrood virus, SBV)活性的dsRNA，实验结果表明，在一定范围内，dsRNA对囊状幼虫病毒复制的抑制效果与dsRNA的饲喂量正相关，在饲喂24、48、72 h后，虫体内囊状幼虫病毒的复制均得以抑制。该研究巧妙地将Cry毒素mRNA半衰期比细菌mRNA平均半衰期长5倍的特点应用于dsRNA的生产，将控制Cry毒素表达的产孢依赖性强启动子 cyt1 Aa置于靶基因 SBV-VP1 的两侧，在产孢阶段无须诱导即可高强度转录下游基因；细菌生长后期自溶释放dsRNA，无须再裂解细胞，节约诱导剂与裂解细胞所产生的费用及时间成本 ^{[1 9]} 。此外，该研究在dsRNA生产质粒中引入了STAB-SD序列，30S rRNA与该STAB-SD 序列的结合可以保护mRNA免受核糖核酸酶活性的影响，从而产生稳定的转录产物 ^[19] 。利用苏云金芽孢杆菌产生靶向鳞翅目害虫的dsRNA，能与Cry毒素形成协同作用，提升对害虫的防控效率与效果。

1.5  昆虫共生细菌

昆虫共生细菌可以自我增殖并源源不断地产生dsRNA，实现双链RNA农药的持久作用，且共生细菌还可以在宿主间进行传播。Leonard 等 ^[20] 改造了蜜蜂肠细菌( Snodgrassella alvi )， 使其可以稳定地定殖在蜜蜂肠道中并产生dsRNA，研究表明产生的dsRNA可以触发RNAi效应，提高蜜蜂在病毒和瓦螨攻击后的存活率。Whitten等 ^[21] 将特异性的dsRNA表达盒分别插 入 到了锥蝽( Rhodnius prolixus )和西方花蓟( Frankliniella occidentalis )的共生菌罗地红球菌( Rhodococcus rhodnii )和肠杆菌( Enterobacteriales BFo2)的基因组中，所产生的dsRNA显著降低了宿主的繁殖能力。但使用共生菌表达dsRNA来遏制病虫害也伴随着潜在的生态风险，还需要进行更充分的风险评估和安全性测试。