华东理工大学最新文章：监测细胞内氧化还原代谢状态的遗传编码荧光探针

近期来自华东理工大学，光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心等处的研究人员以细胞内两对关键的氧化还原代谢分子NADH/NAD+和NADPH/NADP+为例,重点介绍相关荧光探针的设计、性质、应用以及使用注意事项.

基于荧光蛋白的探针成像是近年来生命科学和医学领域迅速发展的一种分析检测技术.由于这些荧光探针实现了在活细胞内实时、动态地监测生物学过程,从而革命性地改变了生命科学研究.相对于化学小分子荧光探针,遗传编码的荧光蛋白探针在精确定位亚细胞结构、消除人为干扰以及活体应用方面,存在显著的优势.

长久以来,NADH/NAD+和NADPH/NADP+的检测主要依赖细胞裂解的酶循环法、色谱法、电化学法、毛细管电泳法以及代谢物间接指示法. 然而,这些方法不仅破坏了细胞或生物体的完整性, 也易在抽提过程中引入人为干扰. 为了在活细胞或活体水平评价细胞代谢活动,研究者主要利用微弱的NAD(P)H自发荧光(激发:340 nm;发射:450 nm). 由于该信号绝大部分来自线粒体, 因此常被用来评价线粒体的功能.细胞浆中NAD(P)H荧光信号通常只有线粒体的1/5~1/4, 且常混入线粒体信号部分, 使得更加难以测定. 

此外,由于NADH和NADPH具有相同的荧光光谱,这种自发荧光分析方法更无法区分NADH和NADPH这两种生物学功能完全不同的代谢物.最近Blacker等人报道,利用荧光寿命成像技术FLIM可以区分结合形式的NADH和NADPH,但是该方式需要高端精密的仪器以及复杂的数学计算,从技术上来讲不是简单的,很难被大多数实验室采用,这样开发原位、高时空分辨地检测NADH/NAD+和NADPH/NADP+代谢的方法显得尤为关键和迫切.

在这篇文章中，研究人员指出为了检测细胞内的代谢物及其微环境,过去的20年研究者相继报道了各种各样的荧光蛋白探针，然而真正能够应用于生命科学研究的不多, 一个重要的原因就是这些探针总是存在某些缺点,如动态范围小、检测范围窄、荧光弱、响应慢等. 

正如Tsien等人在Nature报道首个钙离子荧光蛋白探针,近十几年以来,科学家在Science和NatureMethods等国际顶级杂志不断报道更大动态范围、更高亮度、更快响应、更多颜色、适合活体内应用的钙离子探针,以便更好地解析复杂的生物学问题.因此,开发一个快速响应、高特异性、高灵敏性、高亮度以及大动态范围的荧光蛋白探针一直是科学家们孜孜不倦的追求.

遗传编码的荧光探针实现了在单细胞水平、原位、实时、动态甚至定量分析细胞内氧化还原代谢状态. 针对NADH/NAD+的检测,SoNar探针的出现是对本领域的实质性贡献, 但仍需一个性能更加优越的NAD+荧光蛋白探针,结合现有的NADH探针Frex以及NADH/NAD+比率探针SoNar,可以实现NAD+,NADH及其比率3个关键代谢指标的高精度解析. 

针对NADPH/NADP+的检测,目前仅有两个存在严重缺陷的NADP+探针,NADPH和NADPH/NADP+荧光蛋白探针更是技术空白,需要进一步的技术创新,拟从根本上解决此类问题.

代谢是生命的基本特征. 精确认识细胞内部代谢规律,对发现生命中的化学本质、发展生物工程技术、解析疾病分子机制、促进新药发现均具有重要意义. 在细胞内复杂的代谢网络中,有成千种代谢物,