结直肠癌是严重危害全球的公共健康难题，发病率和死亡率均位居癌症前三[1]。近年来研究发现，结直肠癌的发生发展与肿瘤免疫逃逸密切相关，然而，相关具体机制尚未彻底阐明。
肿瘤细胞往往通过营造独特的肿瘤微环境来逃避免疫[2]。在肿瘤微环境中，巨噬细胞是最丰富的免疫细胞，而且能随肿瘤微环境的变化而改变，极化为M1表型或M2表型。其中，M2表型的巨噬细胞能抑制局部免疫，促进肿瘤免疫逃逸和进展[3]。
近日，江南大学医学院黄朝晖教授和复旦大学黄胜林团队，针对肠癌细胞利用巨噬细胞免疫逃逸的机制，在国际顶尖医学期刊Advanced Science上发表重要研究成果[4]。
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他们发现，肠癌细胞能分泌小细胞外囊泡，囊泡内的miR-21-5p和miR-200a通过PTEN/AKT和SCOS1/STAT1途径，诱导肿瘤相关巨噬细胞发生M2样极化，上调PD-L1表达，进而导致CD8+T细胞活性下降，实现免疫逃逸和肿瘤生长。
首先，研究人员分析了肠癌临床样本，发现越靠近癌症组织中心，M2样巨噬细胞的密度也就越高。体外实验共培养巨噬细胞和肠癌细胞后，巨噬细胞极化为M2表型。这提示巨噬细胞在浸润肠癌组织的过程中发生了表型转变。
随后进一步的生信分析发现，随肠癌病情的进展，发生M2极化的肿瘤相关巨噬细胞比例升高，免疫抑制信号通路富集，PD-L1表达水平上调。生存分析发现，M2样巨噬细胞的PD-L1表达和肠癌预后不良显著相关。
图A：M2样巨噬细胞的密度在肠癌组织中心远高于在组织边缘（CD206为巨噬细胞M2极化的标志物）；图B：与正常肠上皮细胞（NCM460）共培养相比，和肠癌细胞（SW620）共培养的巨噬细胞呈现M2样改变；图G：M2样巨噬细胞PD-L1表达阳性的肠癌患者预后不良
PD-L1作为PD-1的配体，能与T细胞的PD-1结合，诱导T细胞失能和凋亡，进而抑制肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的激活、增殖和抗肿瘤功能[5]。
那么，在肠癌中，巨噬细胞发生M2极化后，是否是通过表达PD-L1来抑制CD8+T细胞，进而发挥免疫抑制作用？
研究人员把巨噬细胞经肠癌细胞共培养处理后，再与淋巴细胞共培养，发现巨噬细胞PD-L1表达上调，CD8+T细胞比例下降，而在共培养过程中添加抗PD-L1抗体则能抑制CD8+T细胞比例的降低。此外，在肠癌病理组织中，PD-L1+M2样巨噬细胞浸润得越多，CD8+T细胞的比例就越低。
图H：巨噬细胞经肠癌细胞共培养处理后，再与淋巴细胞共培养，能降低CD8+T细胞比例；图J：肠癌组织中，PD-L1+M2样巨噬细胞和CD8+T细胞的比例呈反比
这些结果表明，肠癌细胞能诱导巨噬细胞发生M2极化，表达PD-L1，抑制CD8+ T细胞。
但是，肠癌细胞又是通过何种途径来诱导巨噬细胞呢？
小细胞外囊泡是细胞分泌的直径为30-150纳米的细胞外囊泡，是细胞间信号传导的重要载体[6]。之前的研究发现肿瘤细胞外囊泡和免疫逃逸关系密切，据此，研究人员推测，肠癌细胞通过分泌小细胞外囊泡来调控巨噬细胞，以逃逸免疫。
随后，研究人员进行了实验，验证了假说。在体外共培养实验中，巨噬细胞经肠癌细胞来源的小细胞外囊泡共培养处理后，表现出M2样表型，PD-L1表达增加，再与淋巴细胞共培养，能降低CD8+T细胞的比例；在体内实验中，小鼠经注射肠癌细胞来源的小细胞外囊泡后，体内巨噬细胞的PD-L1表达上调。
巨噬细胞经肠癌细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs）共培养处理后，图F：PD-L1表达增加；图G：表现出M2样表型；图I：与淋巴细胞共培养，能降低CD8+T细胞的比例。图H：肠癌来源的sEVs注射至小鼠，体内巨噬细胞中PD-L1的表达上调
小细胞外囊泡携带复杂的生物分子，包括蛋白质、脂质和核酸。其中，miRNA被认为是最重要的信号分子之一。研究人员又大胆推测，肠癌细胞分泌的小细胞外囊泡对巨噬细胞的调控作用，是通过囊泡内的miRNA来介导的。
研究人员对肠癌来源小细胞外囊泡内的miRNA进行了筛选。在肠癌细胞系和肠癌患者中，有四种miRNA显著富集，将它们分别转染至巨噬细胞，只有miR-21-5p和miR-200a能使巨噬细胞发生M2极化，上调PD-L1表达。
为了进一步验证这两种miRNA对巨噬细胞的影响，研究人员进行了功能缺失实验。肠癌细胞经过miR-21-5p和miR-200a敲除后，与巨噬细胞共培养，发现巨噬细胞M2表型减弱，PD-L1表达下调，再与淋巴细胞共培养，则CD8+T细胞的比例增加，功能增强。
最后，研究人员又在体内验证了两种miRNA的功能。小鼠成瘤实验的结果显示，注射miR-21-5p和（或）miR-200a的小鼠，肿瘤生长得更大，组织中PD-L1+巨噬细胞更多，CD8+T细胞更少。
注射miR-21-5p和（或）miR-200a的小鼠，肿瘤生长得更大（图C），组织中PD-L1+巨噬细胞更多，CD8+T细胞更少（图F）
这些数据表明，肠癌细胞分泌的小细胞外囊泡内的miR-21-5p和miR-200a，能诱导巨噬细胞PD-L1表达和M2极化，导致CD8+T细胞活性下降，促进肠癌的发生发展。
那么，miR-21-5p和miR-200a，又是作用于什么信号通路来发挥作用的呢？
生信分析发现，PTEN是miR-21-5p和miR-200a的潜在靶点，SOCS1是miR-21-5p的潜在靶点。实验验证，miR-21-5p能显著抑制PTEN和SOCS1的表达，增加巨噬细胞中p-AKT和p-STAT1的表达，miR-200a能明显抑制PTEN的表达，使巨噬细胞中的p-AKT表达上调。敲除PTEN和SOCS1都能诱导巨噬细胞发生M2极化，降低CD8+T细胞比例。
至此，机制揭示清晰，肠癌细胞分泌小细胞外囊泡，囊泡内的miR-21-5p和miR-200a，通过PTEN/AKT和SCOC1/STAT1途径，协同诱导PD-L1在巨噬细胞中的表达，从而抑制CD8+T细胞功能。
本研究机制示意图
综上所述，黄朝晖教授团队从肠癌的临床病理特点出发，从肿瘤微环境的角度入手，通过丝丝入扣的实验，层层深入地揭示了肠癌细胞的免疫逃逸新机制，为肠癌的免疫治疗提供了一个新思路。从研究方法上看，本研究是一则优秀的“from bedside to bench”研究范例；从研究结果上看，阻断肿瘤相关巨噬细胞中的PD-L1信号，有望成为肠癌治疗的一个新方向。
参考文献
[1] Fitzgerald RC, di Pietro M, O'Donovan M, et al. Cytosponge-trefoil factor 3 versus usual care to identify Barrett's oesophagus in a primary care setting: a multicentre, pragmatic, randomised controlled trial. Lancet. 2020;396(10247):333-344. doi:10.1016/S0140-6736(20)31099-0
[2] Pancione M, Giordano G, Remo A, et al. Immune escape mechanisms in colorectal cancer pathogenesis and liver metastasis. J Immunol Res. 2014;2014:686879. doi:10.1155/2014/686879
[3] Duan Z, Luo Y. Targeting macrophages in cancer immunotherapy. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):127. Published 2021 Mar 26. doi:10.1038/s41392-021-00506-6
[4] Yin Y, Liu B, Cao Y, et al. Colorectal Cancer-Derived Small Extracellular Vesicles Promote Tumor Immune Evasion by Upregulating PD-L1 Expression in Tumor-Associated Macrophages [published online ahead of print, 2022 Jan 17]. Adv Sci (Weinh). 2022;e2102620. doi:10.1002/advs.202102620
[5] O'Malley G, Treacy O, Lynch K, et al. Stromal Cell PD-L1 Inhibits CD8+ T-cell Antitumor Immune Responses and Promotes Colon Cancer. Cancer Immunol Res. 2018;6(11):1426-1441. doi:10.1158/2326-6066.CIR-17-0443
[6] Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020 Feb 7;367(6478):eaau6977.
责任编辑丨应雨妍
