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富含亮氨酸的重复激酶2（LRRK2）活性升高与帕金森病（PD）的发病机制有关。穿越血脑屏障（BBB）的巨大挑战阻碍了对有效LRRK2抑制剂的探索。本文作者利用基于结构的从头设计并开发了稳健的三维定量构效关系（3D-QSAR）模型来预测BBB通透性，从而提高了抑制剂大脑可及性的可能。策略涉及通过将HG-10-102-01的两个末端氮原子与2至4个单元的烷基链连接起来来合成大环分子，为创新的LRRK2抑制剂设计奠定了基础。通过对生化功效和BBB通透性进行细致的计算和合成优化，14种合成候选药物中有9种表现出有效的低纳摩尔抑制和显着的BBB渗透性。对体外和体内有效性的进一步评估，加上药理学分析，突出了8是PD治疗有前途的新型先导化合物。
帕金森病（PD）是一种进行性神经退行性疾病，主要影响老年人，表现为手颤、肌肉僵硬、不自主运动和姿势异常等症状。病情的进展与α-突触核蛋白在大脑中的积累有关，导致神经炎症和神经元死亡。这个过程的特征是神经递质释放中断、小胶质细胞激活和线粒体功能障碍。最近的研究强调，富含亮氨酸的重复激酶2（LRRK2）是帕金森病（PD）发展的关键因素，这归因于它通过损害自噬系统参与促进α-突触核蛋白聚集。LRRK2不仅在大脑中广泛表达，而且在肾脏和肺中也广泛表达。LRRK2的抑制已显示病理性肺变化；然而，这些影响被认为是可逆的，而不是有害的。这些表明靶向LRRK2的抑制剂已显示出逆转PD通路的潜力，而不会产生严重毒性。LRRK2激酶结构域内的G2019S错义突变在家族性和散发性PD病例中尤为普遍。除了这些致病性突变体外，野生型LRRK2似乎在特发性PD患者中表现过度活跃。多种LRRK2抑制剂的临床评估证实，LRRK2激酶活性增加在PD发病机制中起重要作用。尽管LRRK2与PD有关，但其表达范围从大脑延伸到肾脏和肺。已观察到LRRK2的抑制会导致肺部的病理变化，但这种作用被认为是可逆且无益的。这导致人们更加关注LRRK2抑制剂，这些抑制剂可以作为潜在的治疗方法以ATP竞争性的方式减轻这种激酶活性。尽管在过去十年中鉴定出许多有效的LRRK2抑制剂，血脑屏障（BBB）严重阻碍了它们向临床应用的过渡，其中只有少数进入了高级临床试验。BBB充当保护屏障，限制大脑接触潜在有害物质，但也限制许多药物进入大脑内的目标部位。这一挑战使许多LRRK2抑制剂由于无法渗透BBB而无效。为了克服这一障碍，研究人员探索了各种策略，其中大环化成为增强药物BBB通透性的特别有效的方法。大环药物以其环状结构为特征，分子间相互作用减少，否则可能会阻碍它们通过BBB。这种结构刚度，再加上疏水接头的加入，不仅有利于通过BBB，但也可能改善其他药代动力学特性，例如代谢稳定性和生物利用度。此外，LRRK2抑制剂的大环化有可能通过降低与LRRK2结合相关的熵损失来增加其生化效力。这种创新方法有望开发新的、更有效的PD疗法。在通过大环化进行先导化合物优化的初始阶段，我们选择了HG-10-102-01（图1），一种野生型和G2019S突变体的低纳摩尔双重抑制剂。HG-10-102-01具有独特的U形构型和相对较低的分子量（MW），为377.8原子质量单位（amu），被确定为开发大环衍生物的理想分子支架。尽管具有强大的抑制作用，但HG-10-102-01表现出中等药效学特征，受限于其BBB通透性不足和从系统中快速清除。此外，它在基于细胞的分析中的性能适中，在亚微摩尔水平上达到疗效，这强调了进一步改进以满足临床标准的必要性。
图1.HG-10-102-01和DNL-201的化学结构
本研究的目标是构建一个大环衍生物的化学库，这些衍生物表现出改进的BBB通透性。这项工作旨在揭示一种用于治疗PD的新型先导化合物，利用基于结构的从头设计、3D-QSAR分析、体外和体内活性的综合实验验证以及药理学特征评估的协同组合。通过将实验技术与战略计算方法相结合，不仅有望加速发现新的先导化合物，而且可以同时优化其治疗效果和药代动力学属性。
在开始合成新型大环LRRK2抑制剂之前，我们对HG-10-102-01的结构特征及其与G2019S突变体的相互作用进行了深入分析。这种审查旨在确定大环化的最佳位点。图2说明了HG-10-102-01的结构，通过B3LYP/6-31G**水平的从头密度泛函理论（DFT）计算进行改进，以及它在G2019S突变体LRRK2的ATP结合口袋内的参与。对于结构优化和对接模拟，分别使用了Gaussian09和AutoDock。HG-10-102-01的改进3D模型显示了U形几何形状，末端甲胺和吗啉基团的碳原子相距7.1Å（图2a）。因此，通过用2-4个亚甲基单元桥接末端氮原子来形成大环有望压实分子框架，从而可能通过减小的极性表面积促进BBB通透性。图2.（a）在3LYP/6-31G**论水平优化的HG-10-102-01的3D结构和（b）在G2019S变体LRRK2 ATP结合位点的对接姿势HG-10-102-01。分子间氢键用虚线表示。
关于用于LRRK2抑制剂对接模拟的受体模型，我们采用了与三磷酸腺苷（ATP）结合的LRRK2（PDB条目：7LI4）的晶体结构。在LRRK2的ATP结合口袋内HG-10-102-01的预测结合构型中，嘧啶-2-胺基团以双齿方式形成两个氢键。这些键与Ala1950的主链酰胺氮和氨基羰基氧建立（图2b）。计算出的HG-10-102-01的结合模式与ATP的结合模式非常相似，其中六元芳香环上的氮原子相对于铰链区Ala1950的主链酰胺氮充当氢键受体。此外，中心苯基和末端吗啉环附近的羰基氧充当位于铰链区底部的Arg1957侧链胍基团的氢键受体。鉴于Ala1950和Arg1957都位于ATP结合位点，这三个氢键的建立对于分子对LRRK2的有效抑制活性至关重要。对接模拟的见解强调了在化学修饰过程中保留HG-10-102-01的3-(嘧啶-2-氨基)苯甲酰胺组分的重要性，因为它在氢键中起着重要作用。相反，末端吗啉环更多地暴露于溶剂中，较少参与与LRRK2直接相互作用（图b），被确定为被大环化接头替代的候选者。因此，我们产生新的大环LRRK2抑制剂的设计策略侧重于连接HG-10-102-01的末端基团。这种方法有望增强药理学特性和生化功效，通过减少与LRRK2相互作用相关的熵损失来增加结合亲和力，并可能通过减少极性表面积来提高BBB通透性。环衍生物的开发始于精心优化用于连接HG-10-102-01末端基团的烷基链的长度。鉴于其对大环化的适用性，该分子提供了一个有前途的基础，因为预计添加最佳接头可以保持生化效力。该假设基于末端组不会直接与LRRK2相互作用的预测（图b）。
利用这些结构见解和在LRRK2的ATP结合位点观察到的结合模式，作者设计并合成了三种大环衍生物，每种衍生物都通过2、3、4个亚甲基单元的接头长度进行区分。为了确定维持生化效力的最有效接头长度，作者评估了这些衍生物对野生型和LRRK2的G2019S突变体的抑制作用。表1总结了这些大环化合物的化学结构和抑制效率。值得注意的是，1保持了HG-10-102-01的低纳摩尔抑制活性特征，即使其两个末端氮原子用双亚甲基接头桥接形成大环结构。这一观察结果证实了早期的对接模拟结果，该结果确定了HG-10-102-01的3-(嘧啶-2-氨基)苯甲酰胺部分是实现对野生型和G2019S突变体LRRK2的高抑制活性的基本结构特征。随着亚甲基接头从1中的两个单位延伸到2中的三个单位，抑制效力似乎略有增加。然而，将接头进一步扩展到3个亚甲基单元会导致对两种LRRK2变体的抑制效果降低约3倍。重要的是，尽管烷基接头长度不同，但低纳摩尔抑制活性在所有衍生物中始终保持。因此，三种大环衍生物（1-3）作为创新的分子支架，通过进一步的化学修饰能够同时增强生化效力和药理学特征。
为了阐明大环LRRK2抑制剂疗效的结构基础，我们通过对接模拟分析了G2019S突变体LRRK2的ATP结合位点内化合物1-3的结合构型。图3显示，所有三种化合物的结合模式与HG-10-102-01的结合模式非常相似，其中2-氨基嘧啶核心与铰链区中间的Ala1950的主链基团形成两个氢键。然而，在涉及G2019S-2和G2019S-3的配合物中，与中心苯环相邻的羰基氧的氢键是由Ser1954的主链酰胺氮介导的。这与G2019S-1（图3）和HG-10-102-01（图2b）配合物中的相互作用不同，其中氢键供体是Arg1957的侧链胍基团。四种G2019S抑制剂复合物的共同点是通过与Leu1885、Val1893、Ala1904、Ile1933、Leu1949和Leu2001的侧链的疏水相互作用来稳定抑制剂的非极性区域。值得注意的是，从HG-10-102-01到化合物1-3的转变保持了其低纳摩尔抑制效果，强调了LRRK2的ATP结合位点内氢键相互作用和疏水接触的保留。
图3.计算出G2019S突变体LRRK2的ATP结合位点的结合模式为1-3。LRRK的碳原子LRRK2、1、2和3分别以青色、黑色、绿色和粉红色着色。虚线表示氢键。
新的LRRK2抑制剂的设计完全是计算性的，从HG-10-102-01的三种大环类似物开始。为了提高化合物1-3的生化效力和药理学特征，通过对接模拟分析确定了潜在的衍生化位点。例如，用非极性实体替换由烷基接头连接的−NH–基团可以增强范德华与Gly环中疏水残基的相互作用（Leu1885、Phe1890和Val1893）。用小烷基取代基修饰的−NH–基团也可能通过去除对BBB通透性有害的氢键供体来改善药理学特性。嘧啶环上的氯原子提供了改变的机会，以增加铰链区顶端与Ile1933和Met1947的疏水相互作用。由于中心苯基环上的甲氧基与LRRK2的氨基酸残基相距甚远，因此探索该环上的不同取代基可以优化生化效力和药理学特性。鉴于大环衍生物1-3的生化效力和药理学特性有限，它们可能不足作为帕金森病治疗的独立先导化合物。这种不足源于他们的设计强调保持与LRRK2的特定氢键相互作用。为了克服这个问题，合成了一系列1-3的化学衍生物，这些衍生物由它们在分子对接研究中产生的LRRK2结合模式提供信息。这种基于结构的从头设计方法需要通过系统地改变四个特定位置的小化学基团来修饰1-3的结构，以鉴定对G2019S突变体具有增强疗效的衍生物。根据Lipinski的“五法则”严格应用生物利用度标准，以过滤大环衍生物以获得候选药物中必不可少的品质。此外，考虑到LRRK2的大脑位置，使用BBB通透性的粗略指南来选择衍生物。这包括将氢键供体的数量限制在三个以下，遵守对中枢神经系统药物的建议。通过这个细致的三步设计过程，1-3的27个衍生物成为抗帕金森病药物开发的有前途的线索。在抑制剂设计的最后阶段，使用3D-QSAR方法进一步评估了这27种衍生物的BBB通透性，该方法以量子力学为基础，并被证明可有效预测各种药物样分子的药理学特性。BBB通透性的预测涉及计算脑血浆分配系数（LogBB）的对数。为了开发可靠的LogBB预测模型，从文献中汇编了原子组成、形状和大小不同的分子的实验LogBB数据。这产生了一个包含140个分子的数据集，分子量和LogBB值分别从300到500amu和-2.15到1.44不等。在推导出LogBB预测模型之前，根据分子量将分子分为两组，以优化3D结构排列，从而提高模型的准确性。每个子集标记为子集1和子集2，由70个分子组成，子集1中的分子分子量（MW）低于400amu，子集2中的分子分子量（MW）高于400amu。对于每组，分子以55:15的比例分为训练集和测试集。选择每个亚群中分子量最高的分子作为比对模板，以确保结构之间的一致性并最大限度地减少比对不准确。该研究利用了基于全量子力学计算的对准技术，与传统的逐个原子匹配方法相比，有很大的改进。尽管需要大量的计算，但这种精确的比对方法被认为对3D-QSAR模型的成功至关重要，该模型在很大程度上依赖于分子比对的准确性。通过使用详细的分子数据集开发的3D-QSAR预测模型的准确性，通过将预测的LogBB值与其实验等效值进行比较来评估。图4描绘了线性相关图，说明了两个子集内分子的计算和实验LogBB值。训练集的平方Pearson相关系数超过0.99的Alpha值表明，模型在预测子集1和子集2训练集的LogBB值方面具有很高的准确性。尽管R2火车值紧密一致，则测试集的平方相关系数，从子集1的0.786增加到子集2的0.843，表明模型更精确，可以用于预测具有较大MW的分子的渗透率。图4.线性相关图，用于显示（a）子集1和（b）子集2的实验和计算的LogBB值之间的关系。训练集中的分子以黑色表示，而测试集中的分子以红色突出显示。在计算27种大环衍生物的LogBB值之前，它们的原子构型使用适用于上述数据集中分子的方法通过3D结构对齐进行标准化。MWs低于和高于400amu的大环分子分别与子集1和子集2中MWs最高的两个模板分子对齐。图5说明了14和13大环衍生物的3D结构对齐结果，对应于子集1和子集2的模板。对于这两组，衍生物的核心结构定位一致，而它们的取代基表现出不同的方向。从这些排列中获得的原子坐标是计算每个导数的3D静电势分布的基础。然后，这些分布用于通过从数据集分子开发的3D-QSAR模型计算LogBB值。虽然由于具有相同分子核心的所有目标分子的结构相似性，使用1D或2D描述符的传统LogBB预测方法可能会产生与3D-QSAR方法相当的结果，我们选择后者来筛选候选先导化合物，旨在简化实验过程并节省时间和精力。
图5.显示了大环衍生物的3D结构排列结果，展示了（a）MW低于400的那些和（b）MW超过400的那些。模板中的碳原子和大环衍生物分别用黑色和绿色表示。氢、氮、氧、氟和氯原子分别用灰色、蓝色、红色、粉红色和紫色表示。
从通过前面的从头过程设计的27种大环化合物中，仅合成了预测LogBB值高于-0.48的化合物。这14种分子被认为能够穿透BBB，因为估计表明血浆中超过三分之一的这些化合物可以进入小鼠大脑。表2详细说明了结构和IC50这些大环衍生物的野生型和G2019S突变体LRRK2的值，以及它们的计算和实验LogBB值。值得注意的是，预计所有衍生物的效力将优于原始大环核心，无论接头段的长度如何，都具有酰胺−NH–基团的甲基化。这种修改与1-3的对接模拟结果一致，其中酰胺氮朝向一个小的疏水口袋（图3）。从头设计中衍生物的分布产生2分中的8分，而1和3分别贡献了2分和4分，表明用于大环化的三亚甲基接头在生化效力和药理特性之间取得了最佳平衡。
从1（表1）到4（表2）的转变导致生化效力显着降低，这种变化可归因于酰胺氮的甲基化和用氟原子取代甲氧基。通过分别用三氟甲基和甲氧基取代4中的氯原子和氟原子，可以在5中恢复1中观察到的强大的低纳摩尔抑制效果。尽管如此，具有两个亚甲基的大环化策略似乎对治疗进展不太有效，这在从头设计过程中产生的衍生物数量有限，特别是超过4和5的衍生物就证明了这一点。随着2的酰胺−NH–部分在6中甲基化，对野生型和G2019S突变体的低纳摩尔抑制活性略有增加。然而，将甲氧基从6位重新定位到6的中心苯环上5位，产生7，导致生化效力略有降低。相反，用8中的三氟甲基取代嘧啶环6上的氯原子可将抑制活性提高到亚纳摩尔水平。进一步替换9中中心苯环上5位的氟原子会对抑制活性产生负面影响，表明苯环上的额外取代可能会阻碍与LRRK2的结合。即使在嘧啶环的4位点甲基化−NH–基团后，8对G2019S突变体的极低抑制活性在很大程度上得以保留（10）。在11中的中心苯环处引入氟原子可显著降低抑制活性，对野生型和G2019S突变体LRRK2的抑制活性分别降低9倍和12.5倍。此外，在苯基环的6位掺入比甲氧基更大的取代基会导致生化效力降低（12和13）。尽管存在这些变化，但值得注意的是，源自2的8衍生物中有7种对G2019S突变体保持了增强的有效性，这表明三亚甲基单元烷基接头最适合大环化目的。IC50的显著增加从3（表1）到14（表2）的值表明，向中心苯环添加多个取代基会对具有四亚甲基单元烷基接头的大环化合物的生化效力产生不利影响。尽管如此，当将14中的氯原子替换为三氟甲基基团时，再加上将甲氧基从中心苯环上的5位移动到6位（15），抑制活性显著提高了20倍以上。即使通过在16中的5位添加氟原子并将甲氧基扩展到17中的三氟甲氧基来进一步修饰，低纳摩尔抑制活性的这种增强也在很大程度上得以保留。尽管表2中详述的大环化合物在低纳摩尔至亚纳摩尔水平上主要表现出有效的活性，但此时获得G2019S突变体LRRK2的特异性是一项挑战。这种困难可能源于使用G2019S突变体的同源建模结构进行从头设计，这是由于蛋白质数据库（PDB）中缺乏实验确定的结构所必需的。鉴于LogBB是评估BBB渗透率的广泛使用参数，表2列出了3D-QSAR模型预测的LogBB值以及从体内实验中获得的值。计算出的14种大环化合物的LogBB值与实验数据呈中等相关性，反映在平方线性相关系数（R2）为0.536。预测LogBB值的这种适度的准确性主要是由于在分子之间实现完美结构对齐的挑战，这是3D-QSAR方法有效性的关键因素。观察到的差异可能是由于训练集中使用的线性分子与正在分析的大环衍生物之间存在显着结构差异的结果。尽管存在这些挑战，但14种化合物中有9种的LogBB值被准确预测为-0.48，这表明小鼠从血浆进入大脑的可能性很大。其中，7种BBB渗透性分子（5、7-10、13和16）被选为潜在的主要候选分子进行进一步探索。尽管具有相对较高的LogBB值，但由于化合物4和14的抑制性能不足，因此没有在进一步的研究中进行研究，如表2所示。为了评估7种BBB渗透性大环衍生物作为PD前瞻性治疗的潜力，作者对各种药理特性进行了评估。这些评估包括对G2019S突变体LRRK2的细胞水平抑制活性、小鼠微粒体的稳定性以及hERG钾通道的抑制（表3）。细胞抑制效果范围为6.3至333nM，与更局限的IC50相比，范围更广激酶测定的值（0.2-9.4nM）（表2）。尽管在分离蛋白评估中结果一致，但这种差异可能反映了化合物之间膜通透性的差异，而不是靶蛋白亲和力的差异。值得注意的是，相对于HG-10-102-01，大多数大环抑制剂表现出增强的细胞活性，这表明分子环化有助于细胞摄取增加。尽管在细胞测定中具有纳摩尔级效力，但由于小鼠肝脏微粒体的代谢不稳定，化合物5、7、10和16被排除为先导选择，只有9.1-41%的分子表现出稳定性。鉴于这些药代动力学影响，这4个被排除在进一步开发之外。相比之下，化合物8、9和13表现出更高的微粒体稳定性（具有48.7-79.3%的分子对代谢分解有抵抗力），被推进用于额外的药理学评估。然而，化合物13因其在低微摩尔浓度下对hERG钾通道的显着抑制而受到关注，这引起了人们对潜在心脏毒性的担忧。因此，根据全面的药理学和生化数据，8和9被确定为进一步开发为抗帕金森病药物的有希望的候选药物。为了评估它们的选择性，对化合物8和9进行了一组468种激酶的评估。值得注意的是，这些化合物表现出显著的选择性，分别只有7种和9种激酶的活性水平低于10%Ctrl（百分比对照）（见表S3）。
通过检查化合物8和9对G2019S突变体LRRK2的急性抑制，进一步评估化合物8和9作为帕金森病新疗法的治疗潜力，DNL-201作为阳性对照。DNL-201因其开发以及它在体内模型中抑制LRRK2的疗效而被选中。研究了三种化合物的药代动力学特征，显示相对于DNL-201，大环化合物8和9在血浆和大脑中暴露时间延长（表S2）。鉴于有效的LRRK2抑制剂通常以剂量反应方式降低磷酸化，因此从小鼠大脑中G2019S突变体LRRK2与磷酸化Ser935的比例推断出体内疗效8和9。如图6所示，8对G2019S突变体LRRK2产生显着的抑制作用（约66%），与小鼠大脑中剂量为30mg/kg的阳性对照的性能（约62%）非常匹配。此外，在与DNL-201和8相同的实验条件下，9显示出约60%的抑制率略微降低。如表3所示，代谢稳定性的下降进一步强调了8比9的优异体内性能，从79.3下降到48.7%。8的良好体内结果与其强大的体外生化效力和有利的药代动力学特性有关，包括其有效递送到大脑中的靶蛋白。鉴于全面的实验数据，8成为进一步临床前和临床研究的令人信服的候选药物，突显了其在开发新的抗帕金森病疗法中的潜在效用。图6.抑制小鼠脑组织中G2019S突变体LRRK2。化合物口服给药，给药后30分钟收获组织样本。误差线表示标准差（±SD）。实验组包括6只用于载体对照和DNL-201治疗的小鼠（n=6），以及3只用于8和9的小鼠（n=3）。
从基于已建立的HG-10-102-01的大环衍生物（1-3）开始的分子设计工作已经导致鉴定出一种具有帕金森病治疗潜力的新型先导化合物。这种方法利用基于结构的从头设计以及开发可靠的3D-QSAR模型来预测BBB通透性，从而提高设计的LRRK2抑制剂对大脑靶蛋白的可及性。通过将HG-10-102-01的末端氮原子与2到4个亚甲基单元连接来实现大环的有效生成，保留了化合物的原始抑制效力，导致1-3作为后续修饰的基本结构。通过旨在改进G2019S突变体LRRK2抑制和BBB渗透的详细计算工作，14种衍生物中有9种表现出有效的低纳摩尔活性和穿过BBB的能力，其中至少三分之一的分子从血浆到达大脑。这些结果强调了开发大环衍生物化学库作为发现神经退行性疾病潜在治疗方法的功效。在对体外和体内活性以及其他药理学属性进行全面评估后，8被确定为帕金森病治疗开发的突出线索，并表现出与DNL-201相当的有利药理学特性和体内有效性，同时8被强调用于进一步的临床前和临床研究。这项研究展示了通过同时优化疗效和药代动力学特性，利用实验和计算技术加速鉴定新的先导化合物。J. Med. Chem. 2024, 67, 7647−7662
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