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【综述】从分子角度理解细胞色素P450偶联效率以及工程化改造的策略

X-MOL资讯 · 公众号 · · 2022-11-01 08:09

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细胞色素P450（Cytochrome P450s）是一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白，其可以催化多种氧化反应，比如羟基化、环氧化、磺化等。由于可以有效氧化惰性碳，P450在药物和生物合成领域具有巨大的潜力。然而，细胞色素P450在催化过程中经常遇到低偶联效率的问题，从而限制了其在生物催化以及工业化中的广泛应用。偶联效率描述了细胞色素P450利用辅因子NAD(P)H的能力。低偶联效率意味着昂贵的辅因子NAD(P)H在反应过程中会有额外消耗，并生成解偶联副产物，如水（ H ₂ O）、过氧化氢（ H ₂ O ₂ ）以及超氧离子（ O ₂ ^- ）等。尤为严重的是，在反应过程中生成的活性氧副产物会不断积累，最终造成P450酶和用于表达P450酶的工程菌失活。

图1. 通过理性设计底物结合口袋、配体访问通道和电子传递链来改造细胞色素P450酶的偶联效率。图片来源： Biotechnol. Adv.

近日， 德国亚琛工业大学 团队 综述了理性设计具有高偶联效率的P450酶的工程化方法。 研究人员从酶结构和催化机理出发，提出了三类改造P450酶的设计策略：

（1） 稳定P450s 的结合口袋中底物： 高偶联效率需要P450的结合口袋与底物之间具有良好的“互补性”。一方面，合适的结合口袋有利于将底物稳定在正确的取向，以便血红素进行后续的氧化。另一方面，如果底物与结合口袋互补性较差，大量的水分子会涌入结合口袋，导致形成解偶联产物。简言之，稳定结合口袋的关键在于限制结合口袋中的底物运动，使其处于正确的催化构象。

（2） 利用配体访问通道调节底物/产物和水的运输： 细胞色素P450的活性位点埋藏在酶的内部，其催化过程中需要通道来调控底物/产物和水的进出。因此，合适的通道对提高偶联效率极为关键。低效的通道会限制底物和产物的运输，造成底物/产物冗积在结合口袋中，最终导致P450反应流向解偶联途径。另外，藉由通道进入结合口袋中的过量水可作为质子供体，导致解偶联产物的形成。因此，“协调底物/产物有序运输”和“限制水分子扩散”两种策略可用于提高 P450s 耦合效率。

（3） 工程化电子传递链： 电子传递一般是P450反应的限速步骤。如果电子供应不足，P450将倾向于生解偶联产物。然而仅有很少的研究针对于工程化P450的电子传递链。优化P450的电子传递有两种方法，第一种是针对电子传递链上的残基进行改造，特别是流向血红素辅因子的一小段电子传递链。第二种方法是改造影响 P450 血红素结构域和还原酶结构域之间相互作用的残基，例如连接子（linker），这同样可以有效地影响电子传递链的性能，进而提高耦合效率。

基于细胞色素 P450 的结构，可以在计算机上预测潜在的功能化区域，包括结合口袋、配体通道和电子传递链。随着对P450酶的的结构-功能关系的理解的加深，可以预期，蛋白质工程师们能够设计出更高效、更强大的 P450酶，并促进 P450 在药物和生物合成领域中的工业应用。

图2. 用于工程化改造细胞色素P450的最新技术。图片来源： Biotechnol. Adv.

这一成果近期发表在 Biotechnology Advances 上。文章第一作者是德国亚琛工业大学在读博士 孟帅奇 和项目负责人季宇博士。中国科学院天津工业生物技术研究所的 朱蕾蕾 研究员在论文润色方面给予了大力支持。季宇博士、 Mehdi D. Davari 博士、 Ulrich Schwaneberg 教授为论文的共同通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

The molecular basis and enzyme engineering strategies for improvement of coupling efficiency in cytochrome P450s

Shuaiqi Meng, Yu Ji, LeiLei Zhu, Gaurao V Dhoke, Mehdi D Davari, Ulrich Schwaneberg

Biotechnol. Adv. , 2022 , DOI: 10.1016/j.biotechadv.2022.108051

课题组成员介绍

Shuaiqi Meng

博士研究生孟帅奇，2019年硕士毕业于北京化工大学（导师，刘珞副教授），同年10月起在德国亚琛工业大学（RWTH-Aachen University）攻读博士学位，师从Prof. Dr. Ulrich Schwaneberg。目前研究领域集中在定向进化和分子模拟指导下的蛋白质工程改造。

Dr. Yu Ji

季宇博士于2020年在德国亚琛工业大学获得博士学位(Summa Cum Laude)，师从Ulrich Schwaneberg教授。同年，进入亚琛工业大学生物技术研究所/莱布尼兹交互材料研究所进行博士后研究，并于2020年4月起担任亚琛工业大学生物技术研究所塑料降解组组长，主持BMBF/DFG/EU Horizon等11个国家级或国际合作项目，目前的研究兴趣集中在发展酶的定向进化及高通量筛选技术用于生产高附加值产物。

Dr. Mehdi D. Davari

Mehdi D. Davari于Shahid Beheshti University（德黑兰）获得计算物理化学博士学位。之后在德国马克斯•普朗克生物物理化学研究所（哥廷根）和亚琛工业大学生物技术研究所从事计算生物分子化学的博士后研究。2021年4月起在莱布尼茨植物生物化学所担任计算化学组组长。目前的研究兴趣集中通过生物分子模拟和人工智能方法阐明蛋白质的结构-动力学-功能关系和蛋白质设计。

https://www.x-mol.com/university/faculty/302012

Prof. Dr. Ulrich Schwaneberg

Ulrich Schwaneberg教授于1999年在斯图加特大学获得博士学位（导师R. D. Schmid教授，德国），随后在美国加州理工学院从事博士后研究（导师，Frances H. Arnold教授，2018年诺贝尔奖获得者）。于2002年在不来梅雅各布斯大学担任教授。2009年，就任亚琛工业大学任生物技术研究所所长，并于2010年同时在DWI-Leibniz莱布尼茨交互材料研究所任职。他是生物经济科学中心的董事会成员，并且是SeSaM Biotech和Aachen Proteineers公司的联合创始人。目前已发表文章300余篇，申请专利20多项。

https://www.x-mol.com/university/faculty/298967

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