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现如今，几乎所有生物研究领域都会涉及分子克隆技术。所谓的克隆是指，在大多数细菌载体（如质粒）中插入基因序列，之后，研究人员便可大量复制所插入的序列。完成克隆之后，即可对这些序列进行操纵和表达，从而为开展功能性研究提供支持。

传统的 DNA 片段克隆方法涉及将从染色体、质粒或粘粒获得的限制性内切酶消化片段连接到所选克隆载体的特定位点。标准分子克隆技术需要通过酶促修饰和纯化步骤来制备用于连接和转化到细菌细胞中的 DNA 序列。通常情况下，要转移用于克隆的 DNA 序列，首先需要使用限制性内切酶消化 DNA 以产生末端序列突出端（也称为粘性末端），这有助于连接到经过相似处理且具有兼容粘性末端的载体中。在每个消化步骤后，需要去除释放的接头序列，以免其在随后的片段连接期间与所需的插入片段竞争，从而显著增加假重组体的数量。将接头从所需产物中分离出来的最常用的纯化方法是，先进行 DNA 电泳，然后从凝胶中回收所需的 DNA 片段。

虽然限制性内切酶消化在克隆过程中仍然很重要，但其使用方法已然发生了改变。相比于单纯依靠限制性内切酶消化来获取用于克隆的序列，目前主要采用聚合酶链式反应 (PCR) 来生成和制备用于克隆的序列RNA 逆转录产生的 DNA 或 cDNA 可作为 PCR 扩增的模板。PCR 的一个主要优势在于，它提供了一种更为直接的方法，可将限制性位点整合到扩增引物中，从而引入定向克隆扩增序列所需的限制性位点。

标准技术通常涉及多个纯化步骤，每个步骤都会导致大量的产物损失，因此需要大量的起始 DNA 才能保证有足够的载体和插入材料来完成后续的连接和转化步骤。1由于需要生成重组 DNA 分子的应用数量庞大，因此需要一种能够将 PCR 产物或其他来源中的 DNA 片段转化为所需载体的快速方法。

如果样本量较少，则可以使用 Pall Nanosep ^® 等离心超滤装置来执行此类步骤。而对于通量需求更高的应用，可以使用带有相同超滤膜的 Pall AcroPrep™ Advance 96 孔过滤板。随着研究人员需要制作的样本或构建体越来越多，如果能在高通量工作流程中使用过滤板，这无疑十分具有吸引力。

在本科学简报中，我们将介绍如何在各个克隆工作流程步骤中应用这些超滤装置来提供更加简化的工艺，并将这些步骤与传统的 PCR 生成片段的亚克隆方法进行比较。在优化有效靶 DNA 纯化的参数后，我们合成了带有含限制性位点的末端接头序列的 PCR 产物。这些接头经过消化后，产生了适合连接的粘性末端。之后，将得到的 DNA 产物进行浓缩和脱盐，同时通过离心步骤使引物和接头片段流入废弃的滤液（图 1）。

得到的 DNA 片段直接在超滤装置内完成与消化载体的连接反应，然后转化为感受态细胞。使用超滤装置，尤其是 Acroprep Advance 96 孔过滤板，能够大大节省时间、人工和起始材料，且转化重组体的数量与传统技术获得的数量大致相当。