轮胎磨损颗粒（Tire Wear Particles，TWP）是由轮胎与路面摩擦产生的复杂环境污染物，包含金属、多环芳香烃（PAHs）和橡胶添加剂等多种成分。随着人类活动和车辆使用量的持续增长，TWP的全球排放量显著增加，其污染已在空气、土壤和水体等多种环境介质中的广泛存在。其中，水生态系统因径流将TWP带入水体而尤为易受其污染，导致水质恶化，并对生物多样性构成严重威胁。全面研究TWP对生态系统的潜在影响，对于评估其长期环境效应以及可能的公共健康风险至关重要。
多种因素可显著影响TWP的生态毒理学效应，包括化学成分、颗粒大小、浓度、老化状态、暴露时长和环境条件等。例如，金属和有机化合物的存在已被证实会破坏藻类生长，抑制鱼胚胎发育，并引起细胞毒性，从而对水生生物和生态系统健康构成威胁。此外，TWP浓度是决定其毒性效应的关键因素。高浓度TWP会显著干扰生物体的应激反应系统，例如对中华绒螯蟹的研究表明，其暴露于高浓度TWP后会发生氧化应激和细胞损伤。类似地，暴露于光老化TWP的线虫表现出神经毒性效应，包括神经传导紊乱，行为改变和健康受损。长期暴露于TWP还可能增加对海洋桡足类和其他水生无脊椎动物的毒性风险，进而影响食物链和生态系统的稳定性。此外，关于微塑料（MPs）的研究也揭示了颗粒大小在决定毒性方面的重要性。例如，不同粒径的聚氯乙烯塑料对条纹鲶鱼幼体存活率和血液参数的研究强调了颗粒特性的关键作用。类似于微塑料，TWP在水环境中表现出复杂的行为，其生态效应因颗粒特性而异，因此需要进一步研究TWP的颗粒属性如何影响其生态毒理学效应。尽管近年来对TWP生态毒理学的关注日益增加，但针对TWP颗粒大小对水生生物生理和肠道微生物群影响的研究仍然有限。斑马鱼作为一种重要的模式生物，能够通过水体直接暴露于TWP，为研究TWP颗粒大小及其暴露对生态和健康的潜在影响提供了理想的平台。
本研究重点探讨了不同粒径的TWP对斑马鱼肠道微生物群、宿主生理和代谢的影响，并强调肠道微生物群在调节代谢、免疫功能和环境适应中的关键作用。肠道微生物群失衡可能引发免疫和代谢紊乱，从而削弱宿主应对环境压力的能力。研究发现，颗粒大小可能在加剧TWP毒性及扰乱肠道微生物平衡方面发挥重要作用。本研究通过系统评估不同粒径TWP对斑马鱼生长、发育及组织内TWP累积的影响，并结合转录组学分析与抗氧化酶活性测定，揭示了TWP暴露所激活的毒性通路。此外，通过16S rRNA高通量测序，全面表征了斑马鱼肠道微生物群的组成和功能特性。本研究为理解TWP颗粒大小对水生生物潜在毒性的机制提供了新的视角，同时揭示了肠道微生物群与宿主生理代谢之间的复杂相互作用，为生态风险评估和制定减少TWP污染的环境政策提供了重要科学依据。
本研究将成年斑马鱼随机分为四个处理组，每组包含三个生物学重复：未暴露TWP的对照组（CG）以及暴露于不同粒径TWP的处理组（TL：大颗粒，TM：中颗粒，TS：小颗粒）。实验周期为30天，分为两个阶段：第一阶段为15天的暴露期（D15），第二阶段为暴露结束后的15天净化期（D30）。在暴露期结束后，实验移除水体中的TWP，将斑马鱼转移至清洁环境中继续饲养15天，以评估TWP净化对生物生理的影响。TWP的制备和暴露流程详见图1。
本研究系统评估了不同粒径TWP暴露对斑马鱼生理指标的影响（图2）。结果表明，小颗粒TWP（TS组）显著降低了斑马鱼的体重、体长和肠道长度，而大颗粒TWP（TL组）则导致鳃重量显著减少。在净化阶段，多数TWP处理组的生理指标表现出一定程度的恢复，特别是TL和TS组的体重、体长及肠道重量有所改善。同时，TM组的肝体指数（HSI）显著升高，表明斑马鱼在TWP去除后具有一定的恢复能力。总体而言，TWP暴露对斑马鱼生理的影响具有显著的粒径依赖性，而恢复趋势亦与粒径密切相关。本研究结果进一步揭示了TWP粒径在决定其生态毒理效应中的关键作用，为深入评估TWP的环境风险提供了重要依据。
图2 不同粒径的轮胎磨损颗粒（TL、TM、TS）对斑马鱼生长发育指标的影响
TWP暴露引发的氧化应激反应通过评估超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）以及丙二醛（MDA）的活性进行分析（图3）。结果显示，在鳃组织中，TM组和TS组的SOD活性显著升高，而TS组的CAT活性达到最高水平。暴露15天后，所有TWP处理组的GST活性显著下降，同时MDA水平显著升高。在肝脏组织中，TS组的SOD活性显著高于对照组，所有TWP处理组的CAT活性均有所增加，而TM组的GST活性和MDA水平最低。净化阶段结束后，鳃和肝脏组织的氧化应激指标发生显著变化，部分指标如CAT和GST活性出现一定程度的恢复，表明TWP暴露确实诱导了氧化应激反应，而净化阶段可能有助于减轻部分氧化应激的影响。这些结果进一步证明了TWP暴露对斑马鱼氧化平衡的干扰及其恢复能力的粒径依赖性。
图3 不同粒径轮胎磨损颗粒（TL、TM、TS）暴露对斑马鱼鳃和肝脏氧化应激指标的影响
通过转录组数据分析，系统探讨了不同粒径TWP暴露对斑马鱼肝脏转录水平的影响。图4结果显示，TWP暴露显著改变了斑马鱼肝脏的基因表达，不同粒径的TWP展现出粒径依赖性的转录调控效应。在暴露第15天（D15），TL和TM处理组主要表现为下调的差异表达基因（DEGs），而TS处理组则以上调DEGs为主。在第30天（D30），大颗粒TWP（TL处理组）引发的DEGs变化更加显著，表明颗粒大小对TWP的生物学效应具有重要影响。基因本体（GO）和KEGG通路分析进一步揭示了与代谢相关的显著基因表达变化。特别是与外源物降解、脂质代谢、碳水化合物代谢及辅因子和维生素代谢相关的通路在TWP暴露下起到了关键作用。在D15阶段，所有TWP处理组在“外源物降解与代谢”相关通路上表现出显著的基因富集，提示TWP可能通过调控这些代谢通路介导其毒理效应。此外，在净化阶段（D30），KEGG通路分析显示，TL处理组在能量代谢和萜类物质生物合成通路中也出现显著的基因富集。差异表达基因的进一步分析识别出多个关键代谢通路的调控基因，并通过RT-qPCR验证了RNA-seq结果。验证结果表明，
adh5_1
和
cyp7a1
在暴露期间显著上调，而
hadhaa
、
hsd11b2
和
ugt5b4
显著下调。这些数据为理解TWP暴露引发的生理变化及其潜在分子机制提供了重要支持，尤其是在代谢调控与毒性应答的维度上，为后续的分子生物学研究和环境风险评估奠定了基础。
图4 不同粒径轮胎磨损颗粒（TWP）暴露对斑马鱼肝脏转录组的影响
通过16S rRNA测序系统分析了TWP暴露对斑马鱼肠道微生物群的影响。结果显示，不同粒径的TWP暴露未显著改变肠道微生物的门水平主要丰度，
Proteobacteria
（71.3%）、
Fusobacteria
（22.2%）和
Firmicutes
（4.7%）仍为主要优势菌门（图5）。在暴露阶段，TL组的
Proteobacteria
丰度显著下降，而在净化阶段，所有TWP处理组的
Proteobacteria
丰度均有所回升。相反，
Fusobacteria
在暴露阶段显著增加，但在净化阶段显著减少。而
Firmicutes
的丰度在暴露期间，TL组显著高于对照组。在属水平上，TWP暴露显著增加了
Fusobacterium
和
Roseibium
的丰度，同时显著减少了
Acinetobacter
、
Pseudomonas
和
Aquabacterium
的丰度。尤其是在TL组暴露阶段，
Acinetobacter
、
Noviherbaspirillum
和
Methyloversatilis
的丰度显著下降。KEGG功能通路分析显示（图6），TWP处理组的代谢功能显著富集于“氨基酸代谢”、“碳水化合物代谢”、“能量代谢”和“脂质代谢”等核心代谢通路。此外，ASV网络分析结果表明，TWP暴露显著改变了肠道微生物群的相互作用模式。TL和TS处理组的网络复杂性增加，具体表现为节点数和边数增加，但模块数减少，说明肠道微生物群的结构和功能在暴露后趋于复杂化。相关性分析揭示了肠道微生物与代谢功能及宿主生理指标之间的密切联系（图7）。
Fusobacterium
与多个属（如
Rhodobacter
和
Roseibium
）及“外源物降解代谢”通路呈负相关，并且与体重和氧化应激标志物也呈显著负相关。
Acinetobacter
与多个属（如
Pseudomonas
和
Methyloversatilis
）及代谢基因（如cpt2_1和
ugt5b4
）呈显著正相关。
Rhodobacter
则与“氨基酸代谢”和“脂质代谢”等核心通路相关。
Roseibium
表现出与代谢通路、体重和肝脏重量等生理指标的显著相关性。此外，
Methyloversatilis
、
Aquabacterium
和
Noviherbaspirillum
与多个代谢基因（如
adh5_1
和
cyp7a1
）呈正相关（图8B）。这些研究结果表明，TWP暴露引发了斑马鱼肠道微生物群的显著变化，这些变化不仅影响了微生物间的交互网络，还通过代谢功能的调控对宿主的生理健康、代谢功能及应激反应产生深远影响。进一步强调了肠道微生物群在宿主代谢调控及应激反应中的关键作用，为深入理解TWP的生态毒理学效应提供了新的视角和机制支持。
图5 轮胎磨损颗粒（TWP）暴露对斑马鱼肠道菌群组成和动态变化的影响
图
6
轮胎磨损颗粒（
TWP
）暴露对斑马鱼肠道
菌
群功能的
KEGG
预测及网络分析结果
图
7
斑马鱼肠道菌群（属水平）与代谢通路、代谢差异表达基因（
DEGs
）、生理及氧化应激指标的相关性分析
总之，本研究系统揭示了轮胎磨损颗粒（TWP）对斑马鱼的粒径依赖性影响，阐明了不同粒径TWP在生理、生化和生态反应上的显著差异。研究表明，小粒径颗粒（TS组）主要通过引发氧化应激抑制生长，而大粒径颗粒（TL组）则显著干扰代谢通路，扰乱肠道微生物群的平衡，促进致病菌群的增殖，并改变共生微生物网络结构。这些发现突显了粒径对生物响应的关键影响，揭示了TWP暴露引发的宿主与微生物群复杂相互作用的潜在机制，并对水生生态系统健康产生深远影响。同时，研究还发现，斑马鱼在净化阶段能够通过重建微生物群平衡和生理适应表现出一定的恢复能力，这进一步表明水生生物在应对污染压力时具备一定的适应潜力。研究结果为新兴污染物（如TWP）的粒径特异性毒性机制提供了新的视角，并强调了在生态风险评估中考虑颗粒大小的重要性。随着人类活动引发的污染物对水生生态系统的干扰日益加剧，针对微塑料及其他颗粒污染物的多维生态影响，制定科学有效的环境治理政策显得尤为重要。本研究的成果为保护生物多样性和应对全球变化压力下的海洋环境提供了科学依据，强调了通过政策干预减少TWP等颗粒污染物的生态风险的重要性。
