高蛋白浓度冻干药物产品的开发挑战与考量

摘要: 高浓度蛋白质冻干药物产品具有适合ADC及其他稳定性敏感分子的产品稳定性优势，能够加快首次人体临床试验的速度（缩短开发时间），以及允许低体积高剂量的蛋白质治疗药物的皮下给药。成功开发出在药学和经济上可行的高蛋白质浓度冻干药物产品，需要对高蛋白质浓度对关键质量属性和冻干过程的影响有深入的理解，以及实施配方和工艺开发的综合方法。在本章中，我们讨论了与高蛋白质浓度冻干药物产品开发相关的科学基础和独特挑战。还提供了成功开发高蛋白质浓度冻干药物产品的实际指导，以及一种可能的稳定性策略，用于开发可在室温下储存的冻干蛋白质药物产品。

1.引言

自1986年美国食品药品监督管理局（FDA）批准首个治疗性单克隆抗体（mAb）muromonab-CD3（Orthoclone OKT3）以来，单克隆抗体治疗药物已成为过去几十年中多种疾病的主要治疗方式。技术进步极大地加速了单克隆抗体治疗药物的发现和开发。如今，单克隆抗体治疗药物越来越多地应用于肿瘤学、免疫学和血液学等多个疾病领域。许多单克隆抗体治疗药物，如Humira、Dupixent和Keytruda，具有多种疾病适应症。目前，Humira是全球最畅销的药物，通过皮下（SC）注射给药，用于治疗类风湿关节炎和其他TNFα介导的慢性衰弱性疾病。皮下注射具有允许患者在家中自我给药以及在临床环境中由医疗保健提供者使用各种药物输送系统给药的优势。皮下注射还可以显著缩短剂量准备和给药时间，并降低设施成本。

然而，皮下注射传统上每次注射量通常限制在1-2毫升。对于需要高剂量生物制剂（>200毫克）的皮下给药，通常需要高浓度配方。高浓度配方通常含有≥100毫克/毫升的蛋白质，并通过辅料稳定的配方缓冲液来实现。除了高粘度外，高蛋白质浓度还可能导致蛋白质稳定性降低，原因是蛋白质-蛋白质和蛋白质-辅料之间的分子间相互作用增加。在低浓度蛋白质配方中通常被严格控制在极低水平的杂质（如宿主细胞蛋白）可能会在生产过程中与蛋白质共同浓缩，从而影响药物产品的稳定性和安全性。

与液体配方相比，冻干配方通常具有更好的稳定性、便于储存和运输以及更短的开发时间。对于高浓度配方而言，开发稳定的液体配方往往更具挑战性，这一点尤为明显。冻干配方还提供了更大的剂量灵活性。通过调整复溶体积，一种冻干药物产品可以复溶成不同浓度，以满足静脉注射（IV）和皮下注射（SC）的需求。由于这些优势，冻干蛋白质药物产品特别适合于早期临床开发阶段，此时快速进入人体试验（FIH）通常是优先考虑的事项，而用于配方开发的时间和资源有限。如果开发稳定的高蛋白质浓度液体配方不可行，冻干高浓度蛋白质药物产品也可能是商业药物产品开发的一种可行策略。值得一提的是，冻干蛋白质药物产品有可能被开发成室温稳定的药物产品，以便于储存和运输。开发室温稳定的冻干蛋白质药物产品可以使药物在冷链不可用的偏远地区也能使用。

尽管具有这些优势，但在开发高浓度冻干蛋白质药物产品的过程中，可能会遇到一些潜在的挑战，如次优的干燥过程、有限的长期储存和复溶时间慢，这些因素可能会影响液体配方与冻干配方之间的选择。在药物开发的早期使用冻干药物产品，特别是用于首次人体临床试验（例如安全性评估、I期），一个显著的优势是为优化最终配方（即液体或冻干）以满足商业需求提供足够的时间和资源。

本章讨论了高蛋白质浓度药物产品冻干的科学基础以及相关的关键问题。具体而言，讨论了冻干的相互关联过程、相关的变性压力以及更重要的，对冻干蛋白质配方的影响。此外，还提出了成功开发高浓度抗体冻干配方的指导方针。

2.高蛋白质浓度冻干药物产品的特点

蛋白质浓度的增加可能会对冻干蛋白质药物产品的关键质量属性（例如物理外观、饼状结构、粘度、渗透压、复溶时间）和冻干过程（例如初级干燥时间）产生广泛影响。在本节中，我们将讨论高蛋白质浓度冻干药物产品的关键特点。

2.1.物理外观和饼状结构

高蛋白浓度冻干药物产品通常呈现出从灰白色到淡黄色的颜色，这种颜色通常由配方药物物质引起，并随着蛋白质浓度的增加而加深。复溶后，药物产品通常显得乳白。蛋白质配方的乳白通常是由蛋白质分子的瑞利散射引起的，通常被认为是蛋白质药物产品的不良特性。乳白与制药优雅的普遍观念不一致，也容易与由蛋白质聚集和颗粒形成引起的浑浊混淆，引起对药物产品质量的担忧。此外，开发与乳白药物产品外观相匹配的安慰剂产品通常更加困难。研究表明，高蛋白浓度配方中的乳白通常与蛋白质分子的可逆自结合和瞬时蛋白质网络的形成相关。通过改变配方条件（例如pH值和盐浓度）来减轻蛋白质可逆自结合已被证明能够减少高蛋白浓度配方中的乳白。

蛋白质浓度还会影响蛋糕结构。如图1所示，随着蛋白质浓度的增加，冻干蛋白质药物产品的蛋糕变得更加密实且孔隙更少。尽管这种特性使得对于高蛋白浓度药物产品来说更容易获得坚固的蛋糕，但它也使得高蛋白浓度冻干药物产品的复溶更加困难。

图 1 单克隆抗体的冻干程度与上样浓度的函数关系。左上面板：从左到右的加载浓度分别为 40 、 60 、 80 、 100 和 110 mg/mL，同时保持相同的 MAb 和赋形剂总质量。左下面板：扫描冻干固体的电子显微镜检查，用于 40 和 110 mg/mLMAb 负载浓度

2.2.长时间复溶

高蛋白浓度的冻干药品通常表现出较长的复溶时间，从几分钟到数小时不等。如图2所示，复溶时间通常与蛋白浓度呈正相关。从剂量准备和给药的角度来看，长时间复溶是极其不理想的，并且会显著限制冻干药品的实际使用。长时间复溶还可能增加在给药前复溶不完全的可能性，尤其是在患者自行给药的情况下，这可能导致给药溶液中存在未溶解的蛋白颗粒，增加免疫反应的风险，从而影响冻干药品的安全性和有效性。

图 2 蛋白质浓度范围为 40 至 210 mg/m 的冻干单克隆抗体制剂的重构时间

高蛋白浓度冻干药品的长时间复溶通常可归因于其不理想的饼状特性，如润湿性差、吸水倾向低、崩解性差和孔隙率低；最近一项研究表明，高蛋白浓度冻干药品的长时间复溶还可能源于饼状溶解表面的高局部粘度。Kulkarni等人表明，对于>50 mg/mL蛋白的无定形配方，复溶时间主要与“浓缩配方粘度”相关（此处定义为用复溶液体1/3体积复溶后得到的溶液的粘度），而不是饼状特性。然而，复溶时间与完全复溶溶液的粘度相关性较差。作者提出，“浓缩配方粘度”与复溶时间之间的相关性更好，是因为“浓缩配方粘度”更能反映对侵蚀速率、润湿和饼状核心水化有重大影响的饼状溶解表面的粘度。作者还建议，可以使用降低粘度的辅料，如盐酸精氨酸和氯化钠，通过降低“浓缩配方粘度”来缩短复溶时间。考虑到粘度与蛋白浓度之间的关系，有理由相信高蛋白浓度冻干药品的长时间复溶可能源于溶解表面的高局部粘度。据报道，高蛋白浓度还可能通过影响冻干饼的结晶度来影响复溶时间。在研究一种含有Fc融合蛋白、蔗糖、甘露醇和聚山梨酯20的配方时，Cao等人揭示了高蛋白浓度可通过抑制甘露醇的结晶，从而降低冻干饼的结晶度，进而延长复溶时间。作者还表明，在100 mg/mL蛋白浓度下，更高的甘露醇与蔗糖比例可导致结晶度更高的冻干饼和更短的复溶时间。这项研究的另一个有趣发现是，在30–150 mg/mL的蛋白浓度范围内，冻干饼的比表面积保持在约1 m²/g，表明比表面积在这种情况下可能并非复溶时间的关键因素。

2.3.高粘度

蛋白浓度与粘度之间的关系已得到广泛研究。当蛋白浓度相对较低时，蛋白配方的粘度通常会随着蛋白浓度的增加而适度增加。然而，对于高浓度蛋白配方，粘度与蛋白浓度之间通常呈现出近似的指数关系。研究表明，高蛋白浓度下粘度的显著增加通常是由于蛋白分子的可逆自聚集以及瞬时蛋白网络的形成。在将冻干产品复溶为较小体积以实现更高蛋白浓度（这是使用冻干药品的常见策略）的情况下，根据复溶后的蛋白浓度和蛋白本身（即可逆自聚集的倾向以及瞬时蛋白网络的形成），复溶溶液的粘度可能显著高于冻干前的液体配方。由于高蛋白浓度冻干药品通常用于皮下给药，复溶溶液的粘度需要控制在给药装置可接受的范围内，通常低于20–30 cp，以用于自动注射器。可以在配方中加入粘度降低剂，如盐酸精氨酸和氯化钠，以减轻复溶后的粘度。

2.4.更长的一次干燥时间

高蛋白浓度配方的总溶质重量通常超过配方总重量的10%。高溶质含量会导致一次干燥过程中阻力更大（或水蒸气通过干燥层的通量更低），因此一次干燥时间更长，使得冻干过程更加耗时且成本更高。为了避免饼状坍塌，一次干燥通常在最大冻浓缩溶液的玻璃化转变温度（Tg’）或坍塌温度（Tc）以下2–3 °C的温度下进行。如图3所示，Tg’和Tc随着蛋白浓度的增加而增加。在较低蛋白浓度下，Tg’和Tc通常在1–2 °C范围内，可以互换使用。然而，在较高蛋白浓度下，Tc可能显著高于Tg’。据报道，对于高蛋白浓度的无定形配方，在Tg’以上但低于Tc的温度下进行一次干燥可以显著缩短一次干燥时间，但仍能产生药学上可接受的冻干饼。然而，当蛋白浓度相对较低时，同样的一次干燥策略可能会导致冻干饼坍塌。在Tg’以下进行一次干燥的另一个原因是避免蛋白展开，因为蛋白在Tg’以上的温度下热力学不稳定。作者等人的研究表明，即使在远高于Tg’的产品温度下，如果配方具有高粘度，蛋白展开可能仍然太慢，无法在冻干的时间尺度上发生。高蛋白浓度配方通常具有高粘度，因此在冻干过程中对蛋白展开的动力学阻力更大。高蛋白浓度配方的这一特性便于在一次干燥过程中以相对较高的搁板温度进行操作，以减少冻干过程的时间和成本。

图 3 最大冷冻浓缩溶液的玻璃化转变温度和 Tc 与蛋白质浓度的关系。mAb A 的值用三角形表示，mAb B 用圆圈表示，mAb C 用正方形表示，Pro X 用菱形表示。闭合符号：Tg';开路符号：Tc

2.5.渗透压

渗透压是开发高蛋白浓度冻干药品时需要特别考虑的另一个关键质量属性，因为高蛋白浓度配方通常用于皮下给药，要求渗透压为600 mOsm/kg或更低，以尽量减少注射疼痛。大多数蛋白易受到冻干过程和长期储存带来的压力的影响，需要添加稳定辅料以保持其稳定性。由于通常需要一定摩尔比的稳定剂与蛋白才能达到足够的稳定效果，高蛋白浓度配方往往需要更多的稳定辅料，从而使配方呈高渗状态，对患者的舒适性不利。为了尽量降低高蛋白浓度配方的渗透压，通常需要筛选pH值和辅料，以确定在较低摩尔浓度下具有足够稳定效果的稳定辅料。有时，配方科学家在开发配方时可能需要在配方稳定性和渗透压之间进行平衡。

3.高蛋白浓度冻干药品开发中的稳定性考虑

在冻干过程中，可能会出现多种导致蛋白变性的压力，包括冷变性、冻浓缩、冰-水界面、pH变化、相分离和脱水。这些压力可能会直接损害药品在冻干过程和/或长期储存期间的稳定性。在本节中，我们将讨论蛋白在冻干过程中会暴露的主要压力。

3.1.蛋白冷变性

冷变性是指蛋白在低温下自发展开。与热变性相比，冷变性研究较少。根据当前理论，蛋白展开的自由能与温度呈抛物线关系，存在两个展开转变点，其中展开的自由能为零。高于室温的转变点通常被称为热变性点，而另一个通常低于冰点的转变点被称为冷变性点。当温度高于热变性点或低于冷变性点时，蛋白的展开在能量上是有利的。与熵驱动的热变性不同，冷变性是一个焓驱动的过程，主要是由于在温度降低时，非极性基团在水中的溶解度增加，导致蛋白中的疏水相互作用减弱。冷变性可能发生在冻干的冷冻过程中（操作温度为-20 °C至-50 °C），从而损害过程中的稳定性以及长期储存稳定性。以β-乳球蛋白和磷酸甘油酸激酶（PGK）为模型蛋白，作者等人表明，蛋白配方的冷稳定性取决于pH值、蛋白浓度和添加剂，稳定剂（如糖和/或多元醇）的存在可显著增强蛋白的冷稳定性。如图4所示，该研究还观察到在较高蛋白浓度下冷稳定性显著增加，这可能是由于分子间非特异性立体排斥引起的宏观分子拥挤效应。这一结果表明，与低蛋白浓度配方相比，高蛋白浓度配方通常在冷变性方面风险更低。

图 4 通过 DSC 测定的蛋白质浓度对 β-乳球蛋白冷变性温度的影响

在另一项研究中，作者等人研究了低温下蛋白展开速率与系统粘度之间的相关性。结果表明，冻干冷冻步骤中的冻浓缩效应和低温会导致一个高度粘稠的系统，其中冷变性的速率显著降低，因此蛋白冷变性可能不会在远低于冷变性温度的温度下发生。这一结果表明，由于高粘度，高蛋白浓度配方在动力学上可能对冷变性更具抵抗力。

3.2.冻结压力

3.2.1.冻结浓缩

在冷冻干燥的冷冻过程中，蛋白质和其他溶质被排除在冰晶之外，导致溶液中剩余溶质的浓度急剧增加。这种现象通常被称为冻结浓缩。例如，当150 mM NaCl溶液被冷冻到其共晶温度-21°C时，其浓度可以增加24倍，达到3.5 M。冻结浓缩还可能导致蛋白质浓度增加7倍，并将低分子质量碳水化合物的浓度提高到高达80%。任何与溶质浓度相关的性质都可能因冻结浓缩而显著改变，而这种改变可能会导致蛋白质不稳定。例如，由于冻结浓缩导致离子强度急剧增加以及相应的盐浓度增加，可能会导致蛋白质变性和聚集。冻结浓缩还可以增加溶液中杂质的浓度，如活性氧和蛋白酶。Wisniewski等人报告称，由于冻结浓缩，溶液中的氧浓度可以增加1150倍。尽管化学反应速率通常会随着温度的降低而降低，但由于冻结浓缩导致杂质浓度急剧增加，仍然可以加速蛋白质的降解。还有报道称，冻结浓缩中的停留时间对蛋白质稳定性有深远影响，较长的停留时间可能会导致蛋白质聚集显著增加。

3.2.2.冰 - 水界面

在冷冻过程中，随着冰晶的形成，蛋白质暴露于广泛存在于部分冻结状态的冰 - 水界面。蛋白质直接吸附到冰 - 水界面可能会诱导蛋白质展开和聚集。即使没有蛋白质直接吸附到界面，冰 - 水界面诱导的蛋白质变性也可能发生。利用分子动力学模拟，Arsiccio等人证明，冰 - 水界面可以通过增加冰 - 水界面附近水分子的活性来增强界面附近蛋白质的冷变性，这些水分子通过水合蛋白质的非极性基团，从而降低蛋白质展开的自由能障碍。该研究还表明，冰 - 水界面介导的蛋白质冷变性增强可以通过添加抗冻剂（如糖）来缓解。冰 - 水界面的面积取决于冰晶的大小和形态。较大的冰晶通常与较小的冰 - 水界面面积相关。冷冻速率可以直接影响冰晶的大小和形态。在较慢的冷却速率下，可以获得较大的冰晶或较小的冰 - 水界面面积。冰晶的成核温度和冰晶成核后配方的热历史也可以影响冰晶的大小和形态，进而影响冰 - 水界面的面积。在较高温度下进行受控成核已被证明有助于通过促进形成较大冰晶和较小冰 - 水界面面积来降低冰 - 水界面的风险。

3.2.3.pH变化

在冷冻干燥的冷冻过程中，由于缓冲盐的差异结晶，可能会发生显著的pH变化。例如，在冷冻过程中，磷酸氢二钠比磷酸二氢钠更容易结晶，这可能导致pH值降至4.0或更低。磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的差异结晶可能导致最终pH值达到9。由于缓冲盐在冷冻过程中的差异结晶导致的pH剧烈变化，可能会损害过程中的蛋白质稳定性以及在长期储存期间干燥产品的稳定性。对于那些对pH敏感且仅在相对较窄的pH范围内稳定的蛋白质，冷冻过程中pH的变化尤其令人关注。因此，在开发冷冻干燥药物产品时，通常更倾向于选择在冷冻过程中pH变化最小的缓冲盐，如组氨酸、Tris和柠檬酸，而不是那些可能导致pH剧烈变化的缓冲盐，如磷酸氢二钠和磷酸氢二钾。通过优化冷冻过程和配方组成，可以减少冷冻过程中缓冲盐的结晶。有报道称，快速冷冻和缩短退火时间有助于最小化缓冲盐的结晶。在另一项研究中，几种辅料，包括蔗糖、山梨醇、乳糖、海藻糖和葡聚糖，可以减轻或防止磷酸氢二钠的结晶。

3.3.相分离

在冷冻干燥的冷冻过程中，冻结浓缩和低温下溶解度降低可能会使所有溶质在冻结浓缩物中保持单一相变得热力学上不利。因此，配方基质可能会分离成几个不同的相。缓冲盐、填充剂和稳定辅料等配方组分可能会在冷冻过程中结晶并与富含蛋白质的相分离。在冷冻过程中也可能发生液 - 液相分离，这可能导致形成富含蛋白质的相和富含稳定剂的相，以及大量的蛋白质变性液 - 液界面。由于相分离导致的溶液性质（如pH和离子强度）的剧烈变化以及蛋白质与稳定剂的分离，可能会在冷冻干燥过程和长期储存期间损害蛋白质的稳定性。鉴于相分离对冷冻干燥药物产品稳定性的影响显著，因此在冻结浓缩物和干燥状态下检测和控制相分离至关重要。检测晶体相的形成相对较为简单。粉末X射线衍射、偏振光显微镜和振动光谱学等多种技术已被应用于晶体相的检测。然而，检测非晶相的形成通常更具挑战性。差示扫描量热法（DSC）、扫描电子显微镜（SEM）和拉曼成像已被用于检测冻结浓缩物和固态中的非晶相分离。DSC检测到多个玻璃化转变温度通常表明存在多个非晶相。由于蛋白质的热容变化较小（在玻璃化转变期间）以及蛋白质的宽玻璃化转变温度，DSC对富含蛋白质的相通常不太敏感。扫描电子显微镜（SEM）依赖于视觉识别代表非晶相分离的特征。据报道，拉曼成像分析已用于检测几种蛋白质 - 聚合物配方和蛋白质 - 二糖配方中的非晶相分离。

3.4.脱水压力

在水溶液中的蛋白质分子被一层水化壳（或一层水分子单层）覆盖，其重量约为每克蛋白质0.35克。水化壳中的水分子可以与蛋白质表面的极性基团形成氢键，这些氢键对于维持蛋白质的天然结构和构象至关重要。在干燥过程中，蛋白质表面的大部分水化壳被移除，导致稳定氢键的破坏和蛋白质展开。文献中已广泛记录了脱水诱导的蛋白质结构和构象变化。这些变化通常是不可逆的，可能会损害过程中的稳定性以及干燥产品在长期储存期间的稳定性。还有报道称，移除水化壳会导致蛋白质表面电荷的丧失，从而促进蛋白质聚集。如果水对蛋白质的功能至关重要（例如依赖于活性位点中的水进行催化的酶），脱水可能会直接导致蛋白质功能丧失，而不会干扰蛋白质结构。为了在干燥过程中保护蛋白质免受脱水压力的影响，通常会在配方中加入具有功能羟基的稳定剂，如二糖（例如蔗糖和海藻糖）和多元醇（例如山梨醇和甘露醇）。这些辅料可以替代水分子并与蛋白质形成氢键，这对于在固态中维持蛋白质结构至关重要。

4.在冷冻干燥过程和货架寿命储存期间最小化蛋白质降解的稳定性策略

通过添加稳定剂（如糖（例如蔗糖或海藻糖）和氨基酸）以及含有微量表面活性剂的pH缓冲系统，可以提高冷冻干燥药物产品的蛋白质稳定性。

4.1.缓冲盐、表面活性剂和粘度降低剂的选择

为了最小化pH变化，最好选择在冷冻过程中不易结晶的有机缓冲盐，如组氨酸、柠檬酸和Tris。如果由于蛋白质稳定性必须使用磷酸盐缓冲液，则应使用相对较低浓度的磷酸盐缓冲液（例如，≤20 mM），以最小化磷酸氢二钠的结晶，从而减少在冷冻过程中潜在的pH变化。表面活性剂（通常在临界胶束浓度以上）被包含在冷冻干燥的蛋白质配方中，以保护蛋白质免受冷冻过程中冰晶形成的界面应力以及在复溶过程中空气 - 液体界面应力的影响。一般来说，建议使用最少量的表面活性剂，以有效保护蛋白质分子免受冷冻过程中蛋白质 - 冰晶界面应力以及复溶过程中空气 - 液体界面应力的影响。可以将粘度降低剂（如盐酸精氨酸或氯化钠）包含在配方中，以管理高浓度冷冻干燥蛋白质药物产品的粘度。氯化钠倾向于在冷冻干燥过程或货架寿命储存期间部分结晶，这可能会导致蛋白质降解。由于盐酸精氨酸保持非晶态并稳定蛋白质，因此它是粘度降低剂的首选。

4.2.稳定剂的选择

稳定剂可以作为抗冻剂和冻干保护剂，在冷冻干燥过程中保护蛋白质分子免受冷冻和脱水压力的影响。稳定剂还可以保护蛋白质在产品长期货架寿命储存期间免受降解（主要是聚集形成对于冷冻干燥蛋白质药物产品）。在常用的稳定剂中，二糖（如蔗糖或海藻糖）已被证明是有效的冻干保护剂和抗冻剂，并已广泛用于冷冻干燥的蛋白质药物产品。不建议在高浓度冷冻干燥蛋白质配方中使用多糖（如葡聚糖和羟乙基淀粉）和其他聚合物（如聚乙烯吡咯烷酮），因为在冷冻干燥过程中稳定剂和蛋白质之间可能存在相分离。为了在储存期间为蛋白质分子提供足够的稳定效果以防止聚集，需要特定的糖（如蔗糖或海藻糖）与蛋白质的最小摩尔比。在摩尔比为360:1或更高时，蛋白质稳定性得到优化。对于高浓度单克隆抗体配方（例如，150 mg/mL单克隆抗体），蔗糖或海藻糖的浓度应为360 mM或更高（在复溶药物产品中蔗糖或海藻糖的浓度≥12.3% w/v），以实现稳定剂与蛋白质的摩尔比为360:1。一般来说，当配方中含有较高摩尔比的稳定剂与蛋白质时，单克隆抗体更稳定。如图5所示，在不同储存条件（即5°C、25°C和30°C）下研究了150 mg/mL冷冻干燥单克隆抗体（聚集形成率与储存时间平方根的关系）的稳定性。结果表明，随着作为稳定剂的蔗糖浓度增加，蛋白质稳定性得到改善。当150 mg/mL冷冻干燥单克隆抗体配方中含有18%（w/v）的蔗糖时，观察到最佳稳定性，这代表了本研究中评估的最高稳定剂浓度。对于高浓度单克隆抗体配方（例如，150 mg/mL单克隆抗体），含有约9%蔗糖（或海藻糖）的配方是等渗配方，增加蔗糖（或海藻糖）浓度会显著增加配方的渗透压和粘度，而具有过高粘度和渗透压的配方会使制造生产和皮下给药变得困难或不可能。考虑到高浓度蛋白质配方中粘度降低剂（如盐酸精氨酸）对渗透压的贡献，为了实现等渗药物产品，稳定剂的浓度会进一步受到限制。因此，对于旨在皮下给药的高浓度冷冻干燥单克隆抗体配方，通过增加稳定剂浓度来增强蛋白质稳定性显然存在明显的限制。

图 5 150 mg/mL 冻干 mAb 在不同条件下的稳定性（聚集形成速率与储存时间平方根的函数关系）蔗糖作为稳定剂的浓度

4.3.高浓度冻干蛋白药物产品的稳定性策略，适用于室温储存

为了克服仅通过增加稳定剂浓度来提高蛋白稳定性的局限性，需要一种替代策略来提高高浓度冻干单克隆抗体（mAb）的稳定性，同时不会不利地增加产品黏度和渗透压。一般来说，冻干过程旨在从药物产品中去除残留水分，以获得低水分含量的干燥产品，从而实现药物产品的长期储存稳定性。冻干药物产品提供了干燥基质，固定了蛋白分子，防止其降解。然而，也可以加入增塑剂以降低干燥无定形基质中蛋白分子的局部流动性，在某些情况下，增塑剂有助于保持蛋白的天然结构和稳定性。增塑剂包括小分子量的糖醇（如山梨醇和甘油）和其他多元醇，或者是故意保留在冻干蛋白药物产品中的少量水分（水分子）。在冻干蛋白药物产品中使用水分作为稳定剂，不需要在配方中添加额外的辅料，因此不会增加复溶产品的黏度或渗透压。在图 6 中，总结了不同水分含量的 150 mg/mL 冻干 mAb 配方的稳定性。通过聚集形成速率作为储存时间平方根的函数来衡量冻干药物产品的稳定性，结果显示，水分含量最低（约 0% 水分含量或未检出水分含量）的冻干药物产品在 5 °C 至高达 50 °C 的任何储存条件下都没有达到最佳稳定性。对于冷藏（5 °C）和室温储存（25 °C 和/或 30 °C），约 4%（3–5%）的水分含量是最优的。在较高储存温度（50 °C）下，最佳蛋白稳定性的最优水分含量较低（约 2.5%）。这种稳定性策略的优势在于，药物产品中的水分含量不会增加配方黏度或渗透压。因此，通过优化水分含量，可以开发出具有可接受产品黏度和渗透压的等渗稳定高蛋白浓度冻干产品。

图 6 150 mg/mL 冻干 mAb 在不同水分下的稳定性（聚集形成速率与储存时间平方根的函数关系）内容。产品水分含量为 0% 表示水分含量仪无法检测到水分含量

在图 4 中，进一步研究了在约 4% 的最佳水分含量下，高浓度 mAb 冻干药物产品在 24 个月内的不同时间点的稳定性。实验使用 150 mg/mL mAb 等渗配方，在 25 °C 的控制室温条件下进行储存，通过使用凝胶排阻色谱法（SEC）检测主要降解途径（即高分子量聚集物的形成）。与水分含量低于 0.5% 的配方（蓝色曲线）相比，水分含量约为 4% 的配方（红色曲线）在 25 °C 的储存条件下至少在 24 个月内表现出更好的稳定性。冻干蛋白药物产品中相对较高的残留水分含量可以作为无定形蛋白 - 稳定剂基质在“固态”中的有效增塑剂，至少在 24 个月内稳定蛋白，同时在室温下储存（图 7）。

图 7 具有最佳水分含量（~4% H2O，红色）的室温稳定冻干高浓度 mAb 制剂 （150 mg/mL mAb）痕量）和低水分含量（<0.5% H2O，蓝色痕量），一种适用于静脉和皮下给药的等渗制剂

4.4.高浓度冻干蛋白药物产品的共配方

在制药行业，越来越多的人对联合使用生物治疗剂感兴趣，即将针对相同或不同抗原的多种抗体混合在同一药物产品中，特别是在肿瘤学（例如，百时美施贵宝的 Nivolumab + Ipilimumab 共配方用于黑色素瘤）和传染病（例如，Regeneron 的针对埃博拉病毒感染的三重人 IgG1 鸡尾酒共配方）领域。共配方产品的开发技术上具有挑战性，需要将不同的蛋白分子（有时具有非常不同的稳定性特征）配制在同一配方中。蛋白与蛋白之间的不相容性（非天然相互作用）以及异质性聚集物的形成是开发两种或更多蛋白治疗剂共配方用于长期储存的主要障碍。为了将不同的蛋白分子混合在同一溶液中，可能会产生妥协配方，使得每种混合的蛋白分子相对于其独立配方的稳定性较低，尤其是当共配方的蛋白分子对 pH 值、辅料类型和离子强度的偏好非常不同时。因此，开发一种液体共配方对于早期临床开发的时间限制具有挑战性，特别是当需要高浓度蛋白共配方用于皮下（SC）给药时。在这种情况下，考虑到冻干蛋白药物产品具有稳定性高和快速进入临床的优势，冻干共配方可以成为液体配方的可行替代品。一个冻干蛋白共配方的例子是 Durvalumab（抗 PD-L1，Imfinzi®）和 Tremelimumab（抗 CTLA-4）。Durvalumab 和 Tremelimumab 被配制成各自稳定的配方，并以不同的体积比混合，以获得一系列新的液体和冻干共配方，具有不同的蛋白浓度比。与液体共配方相比，冻干共配方显示出显著的稳定性优势，当没有足够的液体共配方稳定性数据（包括长期储存稳定性数据）时，冻干共配方具有更快进入临床的较低风险。

5.最小化复溶时间的配方和工艺策略

在给药前，冻干产品需复溶成溶液。复溶时间是冻干药物产品的一个关键质量属性。对于给定的冻干蛋白药物产品，其复溶时间取决于复溶后的蛋白浓度（图 8）。通常，当冻干药物产品复溶为较高蛋白浓度时，复溶时间会更长。在冻干配方中，随着蛋白浓度从 70 mg/mL 增加到 140 mg/mL，复溶时间从 6 分钟逐渐增加到 16 分钟，正如预期的那样，复溶时间随蛋白浓度增加而增加。

图 8 蛋白质浓度范围为 10 mg/mL 至 100 mg/mL 的冻干样品的复溶时间

5.1.提高饼的润湿性和结晶度

人们认为复溶特性（如复溶时间）与冻干饼的表面积和形态相关。表面积减少可能导致润湿性差，从而延长复溶时间（图 9）。提高润湿性可缩短这些部分结晶饼的复溶时间。在 122 mg/mL 配方中，8% 的结晶度改善了饼的润湿性，从而显著缩短了复溶时间（从 0% 结晶时的 13 分钟缩短到 8% 结晶时的 4 分钟）。在冻干配方中，甘露醇或甘氨酸等填充剂可以在冻干过程中结晶。如表 1 所示，通过 XRPD 显示部分结晶的药物产品配方的复溶时间较短（约 1–5 分钟）。然而，当饼呈无定形时，复溶时间要长得多（约 13–18 分钟）。减少稀释剂体积的复溶方法能够在复溶溶液中实现高蛋白浓度，并且复溶时间较短。数据显示，即使稀释剂体积减半，70 mg/mL 配方的复溶时间也显著缩短（图 10）。减少稀释剂体积的复溶方法实现了最终复溶浓度为 140 mg/mL，且复溶时间较快（约 4 分钟），相比之下，100 mg/mL 配方的复溶时间为 12–14 分钟。与 140 mg/mL 配方的复溶时间（通常在 15 至 28 分钟之间）相比，这种方法实现了 4–7 倍的复溶时间缩短。在真空下进行复溶的程序也有潜力缩短高浓度配方的复溶时间（图 10）。

图 9 重构时间冻干样品（100 毫克/mL 蛋白浓度），其中不同的稀释剂

图 10 重构时间不同的稀释剂体积

5.2.控制成核

据报道，“控制冰晶成核”技术改善了复溶特性，并提出复溶时间的缩短归因于冻干饼中形成了更大的孔隙。在 -5 °C 成核的冻干药物产品比采用传统冻干过程的产品复溶时间更快。值得注意的是，与正常冷冻过程的样品相比，控制成核的样品在复水过程中产生的泡沫要少得多。采用控制成核方法的冻干单克隆抗体药物产品与采用传统冻干冷冻过程的产品相比，复溶时间显著缩短（图 11）。

图 11 重构时间确定为不同的冻结协议和所有 reconstitution 设置配方

6.高蛋白浓度药物产品的冻干周期开发

冻干周期开发在制造用于临床使用和商业化的高浓度冻干蛋白药物产品方面发挥着重要作用，这些产品具有所需的关键质量属性。冻干药物产品的重要质量属性包括可接受的稳定性、不塌陷（或不回熔）的冻干干饼，具有期望的水分含量，以及相对较短的复溶时间，以便于临床使用。冻干过程经过优化，以生产出具有期望质量属性的产品，并且相对较短的冻干周期可最小化制造成本。典型的冻干过程包括冷冻、一次干燥和二次干燥步骤。

6.1.冻结

冻结是冷冻干燥过程的第一步，确保产品溶液处于冻结状态且低于无定形系统的玻璃化转变温度（Tg'）或结晶系统的共晶温度。冻结过程中冷却速率可能会影响过冷度的程度以及冰晶的大小和类型，这可能会对初级和次级干燥速率产生影响。通常，在冷冻干燥机中通过改变冷却速率来操纵过冷度并不现实，因为冷却速率通常限制在每分钟小于2°C，而在如此小的范围内过冷度不太可能发生变化。缓慢冻结还可能会增加易发生相分离系统的蛋白质损伤，并延长蛋白质存在于冰-液界面的浓缩液体状态的时间，在这种状态下生物分子降解反应会加速。通常，每分钟0.5-1°C的冷却速率可以获得合理的过冷度，同时在给定的小瓶内以及从小瓶到小瓶之间形成适度的冰表面积和均匀的冰结构。当配方中使用结晶填充剂（如甘露醇或甘氨酸）来管理复溶时间时，需要进行退火步骤以实现填充剂的有效结晶。退火温度应在无定形相的Tg'和填充剂的Teu之间，以实现高结晶速率和完全结晶。足够的退火时间是完成结晶所必需的。在高于Tg'的玻璃化转变温度的温度下进行退火，有助于冰晶的生长，这降低了产品对水蒸气流动的阻力，从而缩短了初级干燥时间。此外，可以将控制冰晶成核技术应用于冻结步骤，以减少高浓度冷冻干燥蛋白药物产品的复溶时间。

6.2.初级干燥

初级干燥是在冻结步骤之后通过高真空使冰升华的过程，以从药物配方中去除冻结的水分。由于初级干燥通常消耗冷冻干燥循环时间的最大部分，因此优化这一部分过程具有显著的经济影响。优化后的冷冻干燥过程在尽可能高的产品温度下运行，通常比产品塌陷温度（Tc）低几度，以获得外观可接受的干燥产品。Tc通常比蛋白质配方中的Tg'高几度，具体取决于蛋白质和稳定剂的浓度。在典型的蛋白质配方（例如，基于蔗糖或海藻糖的配方）中，随着蛋白质浓度的增加，Tg'也会增加。此外，当蛋白质浓度增加时，Tc和Tg'之间的温差更大，在≥100 mg/mL的蛋白质配方中，Tc可能比相应的Tg'高出15°C以上。因此，高浓度蛋白质配方的Tc通常较高，这使得冷冻干燥过程可以在相对较高的搁板温度下进行初级干燥（例如，搁板温度在0°C或以上），以尽量缩短冷冻干燥过程的总时长。在高搁板温度（例如，>10°C）和快速冰升华速率下进行冷冻干燥时，必须注意不要超出冷冻干燥机的热量和质量传递能力。由于初级干燥中的产品温度相对较高，建议在初级干燥中采用适中的腔室压力（例如100-150毫托），以实现一组玻璃小瓶之间热量传递的最佳均匀性。然而，如果配方中包含大量盐酸精氨酸（例如，≥100 mM）以管理溶液粘度，则需要考虑盐酸精氨酸对产品塌陷温度的负面影响，并相应调整初级干燥条件。对于高浓度蛋白质配方（含有大量无定形稳定剂，如蔗糖或海藻糖），冷冻干燥产品将处于无定形状态，呈现出适度的饼状收缩外观。这种预期的适度饼状收缩通常被视为无定形饼的外观特征，不会对药物产品的关键质量属性产生不利影响，包括蛋白质稳定性、水分含量和复溶时间。可以通过在初级干燥期间以较低的搁板温度冷冻干燥产品，并在次级干燥期间以较慢的升温速率进行操作，从而减轻饼状收缩，但这会导致较长的冷冻干燥周期。然而，为了减轻饼状收缩而过度开发较长的冷冻干燥周期在技术上或经济上都不会带来益处。一般来说，高浓度蛋白质配方（含有较高溶质含量，例如15-20%或以上）会导致在初级干燥过程中饼状物对冰升华的阻力较大，从而在给定的搁板温度和腔室压力组合下，初级干燥时间相对较长。必须有足够的初级干燥时间，以确保完成冰升华且产品不会熔化回流（或饼状物塌陷）。因此，确定初级干燥的终点和初级干燥的持续时间以实现完全的冰升华非常重要。可以通过几种不同的方法检测初级干燥的终点，包括产品小瓶中的热电偶、皮拉尼规和电容规之间测量的腔室压力差，以及气压温度测量（MTM）。在初级干燥结束时，产品温度会上升到搁板温度，冷冻干燥腔中的蒸汽组成从初级干燥期间几乎全部为水蒸气变为主要是空气或氮气。因此，当产品温度接近搁板温度时，可以使用产品温度数据作为初级干燥终点的指示。由于热电偶小瓶由于冻结偏差引起的质量传递效应会比其他小瓶更早完成冰升华，因此通常会增加一个安全裕度，以确保所有小瓶都完成初级干燥。另一种常用的方法是使用皮拉尼压力规和电容压力规之间的压力差，当压力差减小并接近零时，表明初级干燥结束。MTM方法是另一种非常灵敏的方法，用于指示初级干燥的终点。通过将压力上升数据拟合到MTM方程来确定冰的蒸汽压，当冰完全升华时，冰的蒸汽压接近腔室压力，这可以用来确定初级干燥的终点。

6.3.次级干燥

冷冻干燥的最后阶段是次级干燥。在这个阶段，通过从溶质相中解吸来去除冷冻干燥饼中的吸附水。次级干燥的目标是将残余水分含量降低到适合稳定性的水平。为了确保饼状物的完整性，次级干燥的搁板温度应缓慢升高，因为快速升温可能会导致在次级干燥初期，残余水分含量较高且玻璃化转变温度较低的无定形产品发生塌陷。一般来说，对于高浓度蛋白质配方，考虑到其相对较高的玻璃化转变温度，每分钟0.2-0.3°C的适中升温速率是一个安全且合适的操作程序。次级干燥的搁板温度通常高于初级干燥所用的温度，以便在相同的初级干燥腔室压力下，从无定形基质中解吸水分。在较高溶质浓度（包括配方中的高浓度蛋白质和稳定剂，即溶液中固体含量>15%）的情况下，干燥产品具有较小的比表面积，因此更难以去除产品中的吸附水。为了达到冷冻干燥药物产品所需的水分含量，可能需要在相对较高的搁板温度（例如，≥35°C）下进行较长时间的次级干燥（例如，≥6小时），以完成次级干燥。

6.4.冷冻干燥周期放大考虑因素

使用实验室规模的冷冻干燥机开发的冷冻干燥过程需要放大到生产规模的冷冻干燥机，以用于药物生产。实验室和生产冷冻干燥机在搁板温度控制、搁板冷却和加热速率、腔室真空控制以及搁板内和搁板间的温度均匀性方面应具有可比性。此外，还需要考虑生产冷冻干燥机冷凝器容量和冰捕获速率的限制，以确保在初级干燥期间不会过载。当开发用于早期临床试验的冷冻干燥药物产品时，冷冻干燥周期可以相对保守，具有更大的安全裕度，以确保成功放大到生产冷冻干燥机，考虑到快速进入临床和有限的生产批次。保守的冷冻干燥周期在不同生产地点以及不同的生产单元进行药物产品制造时具有优势。然而，对于晚期或商业生产，需要一个优化的稳健冷冻干燥过程，并且必须考虑过程的可放大性以及实验室规模和产品规模单元之间的差异。最重要的冷冻干燥可放大性因素是实验室和商业冷冻干燥机之间的热传递差异、实验室和生产冷冻干燥产品在初级干燥期间对冰升华的干燥饼阻力差异以及过程参数控制的变异性。实验室冷冻干燥机的非典型辐射和边缘效应更为显著，因为商业单元通常具有更好的隔热性能，并安装在受控环境中。应根据实验室和生产规模冷冻干燥机之间的小瓶热传递系数差异调整初级干燥条件（例如，搁板温度设定点和初级干燥时间）。此外，清洁的GMP操作工作环境（即，颗粒物较少）倾向于在冷冻干燥过程的冻结阶段诱导更高的过冷度，特别是对于高蛋白质浓度和高粘度的药物溶液，这会导致形成较小的冰晶和较大的干燥饼对冰升华的阻力，在初级干燥期间需要考虑这一点。在这种情况下，需要延长初级干燥时间，以确保在过程进入次级干燥步骤之前完成冰升华。

7.总结

除了冷冻干燥药物产品的典型优势，包括更好的稳定性（特别是对于抗体偶联药物和其他稳定性敏感分子）、便于储存和运输以及较短的开发时间（适用于早期临床试验）之外，对低体积高剂量皮下给药的蛋白质治疗药物的快速增长需求极大地提高了对高蛋白质浓度冷冻干燥药物产品开发的兴趣。蛋白质浓度的增加可能会对冷冻干燥药物产品的关键质量属性（例如稳定性、粘度、饼状结构、复溶时间）和冷冻干燥过程（例如初级干燥时间）产生直接或间接的影响，因此也会影响药物产品的制造、储存和给药能力。理想的高浓度蛋白质冷冻干燥药物产品将具有以下一种或多种产品质量属性：

• 适合静脉注射和皮下注射的粘度和渗透压
• 临床使用时复溶时间短
• 便于患者在家中使用双室注射器系统（前室为干粉，后室为复溶溶液）等设备进行给药
• 在2-8°C下长期储存和分发稳定
• 理想情况下，室温储存和分发稳定

成功开发出药学上和经济上都合适的高蛋白质浓度冷冻干燥药物产品需要对高蛋白质浓度对关键质量属性和冷冻干燥过程的影响有深入的理解，并实施配方和工艺开发的综合方法。在本章中，我们讨论了高蛋白质浓度冷冻干燥药物产品开发的科学依据及其独特的挑战。还提供了成功开发高蛋白质浓度冷冻干燥药物产品的实用指导。

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