近年来，微塑料污染（MP）已成为环境科学和生态学领域的第二大科学问题。轮胎微塑料（TWP）被认为是环境中最大的微塑料污染源之一。大多数TWP（90.0%–99.9%）以非空气传播颗粒物的形式沉积在路面上，只有一小部分（0.1%–10.0%）以空气中颗粒物的形式排放。非空气中的TWP最终通过径流或废水处理进入环境，一旦TWP被引入水生系统，各种有毒添加剂就会从颗粒中浸出。由于TWP的来源多种多样，并且有可能通过多种途径进入地表水环境，因此TWP已在水库、湖泊、海洋、城市污水系统、河流甚至地下水中被广泛检测到。然而，有关环境浓度下TWP浸出液慢性毒性的研究仍然很少。在此，我们研究了环境浓度（0.3 mg/L和3 mg/L）的TWP浸出液对多代和跨代蚤状溞的影响，每代 暴露21天，连续三代（F0-F2）。分析了各代的生长和繁殖指数（体长、生长率、首次繁殖时间、繁殖次数和繁殖总数）。研究结果表明，多代暴露于TWP浸出液不会导致蚤状溞死亡，但会损害其生长发育、延长性成熟时间并降低繁殖能力。跨代暴露组（3 mg/L）也表现出一些亚致死效应，如生殖延迟，存在跨代影响。基因转录分析和基因共表达网络分析（WGCNA）显示，与溶酶体功能、细胞凋亡和谷胱甘肽代谢相关的通路受到显著影响，
APs
、
CTSB
、
GST
、
DUSP1
和
ERN1
基因的表达水平受到干扰，表明暴露于TWP浸出液损害了免疫防御机制，这些发现强调了实际环境浓度的轮胎微塑料浸出液对水生生物的多代毒性效应和传递模式（图1）。
本研究的暴露实验设计如图2所示。根据环境TWP浓度（0.5–3.6 mg/L），设置了不同的暴露组（0.3和3 mg/L）。F0-F2代蚤状溞连续暴露于TWP浸出液，即为多代暴露。仅F0代蚤状溞在暴露于TWP浸出液为跨代暴露。选择健康幼溞（<24小时，第三胎）用于研究。每个实验组设置10个重复，每代暴露均为21天。
在本研究中，长期暴露于环境浓度TWP浸出液不会导致F0-F2代蚤状溞发生任何非自然死亡。暴露于不同浓度（0、0.3和3 mg/L）TWP浸出液组的动物生长和繁殖在F0代蚤状溞中没有显着差异（p>0.05；图3A-E）。与对照组相比，F1代3 mg/L TWP浸出液的多代暴露组个体体长和生长速率显着降低（p<0.05；图3A、B）。然而，F2代中，0.3 mg/L和3 mg/L多代以及3 mg/L跨代暴露组的体长和生长速率均有显着增加（p<0.05；图3A、B）。根据“分配原则”，我们推测水蚤由于处于压力之下，所以调整了生存策略，将更多的精力分配给生长和发育，以保护自身抵御不利环境的影响。在生殖方面，各代各组的繁殖次数没有显著差异（p>0.05；图3D），F1和F2代3 mg/L多代暴露组的繁殖总量大大减少，并且后代数量随着暴露世代数的增加而减少（p<0.05；图3E）。尽管跨代暴露组的繁殖总量没有显着地减少，但这种暴露仍然对其生殖能力产生了不利影响。在F2代3 mg/L多代暴露组中，发现水蚤首次繁殖时间显著推迟，性成熟时间明显延长（p<0.05；图3C）。以上繁殖的相关参数表明长期多代暴露于环境浓度的TWP浸出液会抑制蚤状溞的繁殖能力。与跨代暴露相比，多代暴露对蚤状溞生长繁殖的影响更大，尤其是在繁殖过程中，因为暴露于目标化合物会削弱后代，导致后代更易感，所以毒性作用往往会随着世代数的增加而加剧。
图3 蚤状溞的生长和繁殖指标
CK，对照组；M，多代暴露组；T，跨代暴露组；大写字母表示每代之间存在显著差异（双因素方差分析，p<0.05）。小写字母表示同一代内不同处理组之间的显着差异（单因素方差分析，p<0.05）
考虑到F2代在生长和繁殖方面的特殊特性，选择它进行转录组分析。与对照组相比，3 mg/L多代暴露组总共鉴定出677个差异表达基因（DEGs），其中有527个DEGs显著上调和150个DEGs显著下调（图4A）。在跨代 3 mg/L暴露组和对照组中共鉴定出419个DEGs，其中226个和193个DEGs分别显著上调和下调（图4B）。对差异基因进行KEGG通路富集分析，结果显示在3 mg/L多代暴露组中，核糖体、溶酶体、谷胱甘肽代谢、军团菌病和细胞凋亡途径受到的影响最显着（图4C）。而溶酶体、细胞凋亡和谷胱甘肽代谢途径在3 mg/L跨代暴露组中同样被显著富集（图4D）。因此，我们推测TWP浸出液可能通过破坏蚤状溞的免疫防御机制来影响生长和繁殖过程。
图4 F2代的转录组差异表达基因火山图和KEGG富集分析
（A）3 mg/L多代暴露组和（B）3 mg/L跨代暴露组的差异基因火山图，蓝色散点表示差异不显著的基因，而红色和绿色散点分别表示显著上调和下调的DEGs。（C）3 mg/L多代暴露组和（D）3 mg/L跨代暴露组与对照组相比的KEGG通路分析。Y轴表示通路，X轴表示基因比例。气泡的颜色和大小分别代表通路富集的显著性和富集在该通路中的基因数量。
进一步对显著富集通路的基因进行挖掘。与对照组相比，F2代3 mg/L跨代暴露组的
AP
表达显着增加（p<0.05；图5A），而
ERN1
表达显著降低（p<0.05；图5F）。3 mg/L多代暴露组中，
CTSB
、
GST
和
DUSP1
表达水平显着升高，而
ERN1
表达显着降低（p<0.05；图5B，D-F）。
AP
、
CTSB
和
LIPA
是参与溶酶体途径的与免疫相关的水解酶基因。
AP
、
CTSB
和
LIPA
是参与溶酶体途径的免疫相关水解酶基因。
CTSB
在维持溶酶体功能以及细胞凋亡和自噬中起关键作用。GST作为抗氧化系统中一种重要的氧化应激标志物，与免疫系统密切相关，因为氧化应激会损害免疫细胞并抑制溶菌酶活性或免疫相关蛋白。
DUSP1
和
ERN1
（内质网到细胞核信号1）是细胞凋亡通路中的关键基因，污染物感染会诱导机体发生细胞凋亡，从而促进
DUSP1
的表达，而内质网应激可以调节细胞自噬和细胞凋亡，是一种广泛的应激防御机制。
A，
AP
；B，
CTSB
；C，
LIPA
；D，
GST
；E，
DUSP1
；和F，
ERN1
。CK，对照组；M，多世代暴露组；T，单世代暴露组，n=3，p<0.05。
为了进一步确定TWP浸出液暴露影响蚤状溞生长和繁殖的分子机制，我们通过基因共表达分析（WGCNA）揭示了生长和繁殖的关键基因模块。以生长和繁殖指标（体长、生长率、首次繁殖时间、繁殖次数和繁殖总量）为性状因素，构建基因模块和性状相关性分析，筛选基因模块，获得不同模块与不同生长和繁殖参数相关性强度的结果。利用Cytoscape软件（V3.9.0）的默认参数导出每个模块的基因，再对WGCNA模块的特征基因进行了GO和KEGG富集分析。WGCNA分析一共构建了15个基因共表达模块（图6B）。其中，绿色模块（r=-0.9）与体长和生长率的关联最强，呈最大负相关；黄色模块（r=0.67）与体长和生长速率呈最大正相关；蓝色模块（r=0.95）与总繁殖量呈最大正相关；棕色模块（r=0.90）与首次繁殖时间呈最大正相关，而洋红模块（r=0.95）与繁殖次数呈最大正相关（图6C）。
对绿色模块的基因进行GO富集分析，结果显示“刺激反应”、“细胞对刺激的反应”以及“防御反应”等多个与免疫相关的生物学过程被显著富集（图7A）。随后对黄色、蓝色和棕色模块进行了KEGG通路分析，黄色模块的基因富集到氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢、溶酶体及药物代谢-细胞色素P450等通路（图7B）。蓝色模块的基因显著富集到核苷酸切除修复等分子过程（图7C），而棕色模块主要富集于如嘌呤代谢等代谢过程（图7D）。核苷酸切除修复在机体对外部压力源的防御中起着关键作用，并且是保护机体免受化学致癌物引起的DNA损伤的关键机制。嘌呤能信号与其他神经递质系统相互作用，调节包括增殖、分化、迁移、凋亡等关键细胞过程，这些过程对于机体正常生理功能的维持至关重要。WGCNA分析进一步证明了TWP浸出液暴露可能会破坏蚤状溞的免疫防御机制，导致其生长和繁殖的正常功能受损。
图6 WGCNA分析中与生长和繁殖相关的关键基因模块
A，尺度独立性、均值连通性和无尺度拓扑图；B，共表达网络模块的簇状树状图；C，模块与生长和繁殖指数之间的相关性。第一列为不同的基因模块，每个模块由不同的颜色表示。红色表示正相关，蓝色表示负相关。绝对值越大，相关性越强。
图
7
绿松石模块（
A
）的
GO
富集分析和黄色模块（
B
）、蓝色模块（
C
）和棕色模块（
D
）的
KEGG
富集分析
