中医药一区6+思路，单细胞转录组揭示三阴性乳腺癌槐耳调节机制

Phytomedicine 上发表的新文章通过单细胞转录组技术发现Huaier通过抑制CAFs的转化和调节TGF-β/SMAD信号通路增强TNBC对免疫治疗的响应，并强调Huaier作为免疫疗法中的有效辅助剂的重要作用。

方法

数据来源： 从山东大学齐鲁医院收集TNBC患者样本并进行单细胞转录组测序；从TCGA获取TNBC转录组数据。

单细胞转录组分析： 使用R包Seurat处理数据，FindAllMarkers函数识别DEGs并基于DEGs 和已知基因特征进行细胞注释；使用R包inferCNV以髓样细胞为参考计算恶性细胞中的CNV；使用R包Monocle 2进行伪时序分析。

细胞间通讯分析： 使用R包CellChat计算CAFs和淋巴细胞间的通讯程度；通过CellPhoneDB进行基于受体-配体对的细胞-细胞通信分析。

qRT-PCR和Western blotting： 用于评估Huaier对CAFs的抑制作用及其对TGF-β/SMAD信号通路的影响。

免疫组化（IHC）： 用于分析Huaier对肿瘤组织中CAFs标记物表达和T细胞浸润的影响。

动物模型实验： 通过建立荷瘤小鼠模型，验证了Huaier对免疫细胞浸润和肿瘤进展的影响，以及与PD1阻断剂的协同效应。

结果

目的： 探索槐耳对小鼠4T1移植瘤内肿瘤微环境中细胞群体的影响。

结果：

1. 将免疫功能正常的BALB/c小鼠随机分为对照组和槐耳组，并在给药后进行scRNA-seq测序（图1A）；

2. 使用t-SNE进行聚类分析将细胞分为7种主要细胞类型，包括癌细胞、CAFs、髓系细胞、淋巴样细胞、中性粒细胞、内皮细胞和壁细胞（图1B）；

3. 与对照组相比，槐耳组中淋巴细胞的浸润显著增加，而CAFs则明显受到抑制（图1C）；

4. 进一步的重聚类分析确定了26个亚群，并基于细胞群间DEGs进行了GO分析（图1D，E）。

图1

目的： 探究槐耳如何诱导癌细胞凋亡。

结果：

1. 对Epcam+细胞进行重聚类确定了5个不同功能癌细胞亚群，包括复制DNA的癌细胞、分裂细胞、缺氧癌细胞、免疫反应性癌细胞和凋亡癌细胞（图2A，B）；

2. GO分析显示，这些亚群与DNA复制、细胞分裂、缺氧反应和凋亡过程等相关；

3. 通过计算CNV状态发现癌细胞中的CNV变异性明显高于非癌细胞（图2C）；

4. 伪时序分析显示，槐耳处理导致癌细胞从DNA复制和细胞分裂状态向凋亡状态转变（图2D，E）；

5. 与对照组相比，槐耳组中凋亡癌细胞亚群的比例显著增加，进一步证实伪时序结果（图2F）。

图2

目的： 探究槐耳如何增强T细胞在肿瘤微环境中的浸润和激活。

结果：

1. 将淋巴细胞重聚类并基于细胞标志物进行注释，包括CD4+naïve T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和Tregs（图3A，B）；

2. t-SNE图显示槐耳组中CD8+T细胞的浸润密度增加（图3C）；

3. 两组间的T细胞亚群比例存在显著差异，特别是CD8+T细胞和Tregs的比例（图3C）；

4. 火山图分析显示槐耳显著上调了与免疫相关的基因表达，包括细胞毒性颗粒相关酶和先天免疫效应分子（图3D）；

5. GSEA分析显示，与T细胞激活相关的生物学途径在槐耳处理后被激活（图3E）；

6. 这些结果表明槐耳诱导的T细胞活化有效地促进了TNBC细胞凋亡。

图3

目的： 探究槐耳调节肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）分化的机制。

结果：

1. 应用scissor算法关联单细胞数据与TCGA队列，发现CAF簇与TNBC中的不良OS密切相关（图4A）；

2. 对CAF簇进一步分析并基于典型标记和DEGs确定了包括Crabp1+CAFs、myoCAFs、rCAFs、增殖CAFs、炎症CAFs和抗原呈递CAFs在内的多个CAFs亚群（图4B-D）；

3. 与对照组相比，槐耳组中myoCAFs的比例显著减少；

4. 伪时序分析揭示了CAFs的分化轨迹，显示myoCAFs是从rCAFs分化而来；

5. GSEA分析表明，与炎症反应相关的生物过程在myoCAFs中被显著抑制,表明该亚群可能在免疫功能障碍中发挥关键作用（图4E）；

6. 火山图显示，槐耳处理显著减弱了myoCAFs标记基因α-SMA和FAP的表达（图4F）。

图4

目的： 实验验证槐耳的调节作用。

结果：

1. 槐耳显著降低了患者来源CAFs中α-SMA的转录和蛋白表达水平（图5A，B）；

2. KEGG分析显示，Huaier处理显著影响了TGF-β信号通路（图5C）；

3. 槐耳以剂量依赖性方式降低了TGF-β1和TGF-β2的转录水平，而TGF-β3的表达未受影响（图5D）；

4. 细胞迁移实验表明，槐耳提取物显著减弱了CAFs培养基诱导的TNBC细胞迁移能力（图5E）；

5. Western blot分析显示，槐耳降低了SMAD2和SMAD3的磷酸化水平（图5F）；

6. 这些结果表明槐耳可能通过抑制TGF-β/SMAD信号通路调节CAF分化。

图5

目的： 探究myoCAFs与CD8+T细胞的互相作用，挖掘临床价值。

结果：

1. CellChat分析显示，myoCAFs与CD8+T细胞在TIME中形成紧密相互作用（图6A）；

2. CellPhoneDB分析显示，与其他CAFs亚型相比，myoCAFs和增殖性CAFs与免疫细胞的串扰增强（图6B）；

3. 与抑制性TIME相关的受体-配体对（如PDCD1-FAM3C）是CD8+T细胞和myoCAFs之间通讯的关键参与者（图6C）；

4. 应用TIMER 2.0的相关性分析显示，高水平的myoCAFs标记物α-SMA和FAP与CD8+T细胞浸润的减少有关（图6D）；

5. TCGA队列分析显示，myoCAFs的积累与TNBC患者预后不良显著相关，证实了myoCAFs在TNBC的重要性（图6E，F）；

6. 利用BCIP平台比较正常与肿瘤组织中myoCAF标志物表达水平，发现FAP在肿瘤中的表达显著更高（图6G）。

图6

目的： 探讨槐耳在免疫治疗中的协同治疗效果，挖掘临床价值。

结果：

1. 小鼠体内实验结果表明，槐耳以剂量依赖性方式显著抑制了TNBC肿瘤的生长（图7A-C）；

2. 值得注意的是，DOX组小鼠体重显著下降，而低剂量和高剂量槐耳治疗组均未观察到严重副作用（图7D）；

3. 与单独使用槐耳或抗PD1抗体相比，联合治疗显著减缓了肿瘤生长，并且没有明显改变小鼠的体重（图7E-H）；

4. IHC分析显示，槐耳治疗以剂量依赖性方式明显抑制α-SMA+细胞，并在抗PD1治疗组和槐耳治疗组中增加了CD3+和CD8+T细胞的浸润，特别是在联合治疗组中效果更为显著（图7I）；

5. 综上，槐耳可以通过靶向肿瘤内CAFs中的TGF-β/SMAD信号通道来显著增加CD8+T细胞的浸润，从而改变肿瘤微环境来提高免疫治疗的效果（图7J）。

图7

结论