力学细胞学：论细胞如何通过挤来挤去影响彼此的生命历程

原文以Mechanobiology: A measure of molecular muscle为标题

发布在2017年4月12日的《自然》科技专题上

原文作者：Michael Eisenstein

创新工具帮助揭示引导胚胎发育和肿瘤生长等细胞过程的力。

在显微镜下，细胞往往呈静态 — 具有生物结构的固体元素。然而在现实中，它们是动态的结构，在拥挤的环境中挤来挤去以获得空间。细胞挤压、拉伸、弯曲和牵拉它们周围的东西以及彼此，这样做的时候会产生力的作用。这些力极小 — 在皮牛顿的级别，或者说略相当于一个曲别针重量的十亿分之一，但仍能产生重大的生物学影响。在快速生长的胚胎中，不断变化的作用力能够改变细胞的发育过程，告诉它们什么时候停止分裂并开始转变为大脑或骨骼。

细胞中的蛋白质结构承受并产生微小的力，科学家正在学习如何在微观尺度上对其进行描绘。

Carsten Grashoff

一个世纪前，苏格兰科学家D'Arcy Thompson提出物理上的力会影响细胞功能的观点。他在他的开创性著作《生长和形态》中写道：“细胞与组织，壳与骨，叶与花，是物质的不同表现形式，其粒子的移动、塑造和成型遵守物理学定律。”

Thompson基本为理论性的工作为大量的生物力学原理实验研究铺平了道路。德国慕尼黑马克斯普朗克生物化学研究所研究细胞力的Carsten Grashoff表示：“生物力学是一个非常古老的领域 — 只是人们长期忽视了它。”从某种程度上来说，这是由于研究人员缺乏能够精确测量分子级别力的技术。

现在，科学家们已经有了工具，能够在显微镜下描绘皮肤细胞在伤口愈合时向前爬的力，或者对细胞编码使之能够在蛋白伸展和放松时闪烁。但困难仍然存在 — 研究人员很难从随机的生物噪声中分辨出细胞力的真实影响，而且还没有彻底搞清楚这些过程如何在活的有机体这种复杂环境中发挥作用。但是， 通过将“力学生物学”工具与其他遗传学的和生化活动的测量手段结合起来，研究人员开始可以了解力如何被转化为功能。

加州斯坦福大学的机械工程师Beth Pruitt说：“生命过程不仅仅是生化信号通路。当你拉一个蛋白质，你可能打开或关闭了一个结合位点，从而按下了开关，选择了哪一个程序将被细胞运行。”

获得牵引力

细胞主要通过嵌在细胞膜上的蛋白质与环境相互作用，这代表了产生和解释细胞力的关键点。一些蛋白质会响应液体流动对其产生的“推力”，就像在血管中的情况；而另一些蛋白质在细胞被其邻近细胞拖拽或黏附到其他邻近蛋白质时，产生与张力相关的信号。

20世纪90年代，牵引力显微镜 （TFM） 出现，成为第一个真正可以定量测量这种力的工具。 例如，1999年，当时供职于伍斯特麻省大学医学院的Yu-Li Wang和附近波士顿大学的Micah Dembo，将一种称为成纤维细胞的结缔组织细胞铺在一种嵌入了荧光微珠的凝胶材料上。随后他们展示了可以使用TFM，通过测量微珠的位移来推算出这些细胞产生的力。德国埃尔朗根-纽伦堡大学的生物物理学家Ben Fabry说：“这就像一个弹簧秤，你对弹簧秤施重并测量其变形程度，如果你知道弹簧的刚度，你就能确定力的大小。”

TFM已经成为研究单个细胞和组织样互连细胞片层的标准方法。Clare Waterman任职于马里兰州贝塞斯达的国家心脏肺血液研究所，她已经使用TFM来研究细胞迁移，该过程在一定程度上由被称为黏着斑的细胞结构将自身粘连在周围细胞外基质 （ECM） 上时所产生的力介导。

Waterman小组开发出了相关方法来增加TFM实验可以成像的微珠数量，以便产生超高分辨率的力图。她说：“我们可以在每个黏着斑下设置50个标记物，所以我们可以达到亚微米级别的分辨率。”这使得她的小组能够揭示在黏着斑处产生的力，是如何触发在胚胎发育等过程中协调定向细胞运动的分子事件。

当然，微珠对细胞运动的响应是一个多维移动，这种多维移动比一维的弹簧秤变形要复杂得多。TFM最初需要强大的超级计算机来解读数据，不过现代计算方法已经使该技术更易使用。即使如此，将微珠的位移数据转换成力的测量仍然具有挑战性，并且存在很多潜在的错误源。Waterman说：“可能有一个单细胞在相反的方向拉，使它看起来基本上没有形变。而且当微珠的运动超出了细胞的边界，就将很难处理。”

其他研究团队正在将TFM扩展到三维，以更好地映射生物学上的实际情况。例如，Fabry和他的同事开发了一种TFM方法，使用胶原蛋白构成的凝胶，在三维跟踪细胞力，胶原蛋白是ECM的一种关键的蛋白质成分。他的团队能够探测乳腺癌细胞的形状、细胞产生的力、以及细胞通过一种合成的三维‘组织’时的速度和方向这几者之间的关系——有望为癌细胞的转移生长建模。

但他的方法也加大了对分析和计算的挑战。Fabry说：“胶原蛋白是非常难处理的材料 — 它的行为是高度非线性的，也就是说，如果你稍微拉伸它一点，它是柔软的，但如果你多拉伸一点，它会突然变得非常僵硬。”

为了避开这个计算上的负担，新泽西州普林斯顿大学生物医学工程师Celeste Nelson在她的器官发育研究中采用了较低分辨率的数据。她说：“我们更关心的是在上百或上千细胞的总数中找到力的大小的相对差异。然而，力的产生从根本上来说是动态的；需要在多个时间点收集这些三维数据，她说：“这样计算量自然会暴增。”

另辟蹊径

一些研究人员选择了一种更简单的方法，他们使用小而设计精准的各种聚合物芯片，直接读出细胞力。马萨诸塞州波士顿大学的生物工程师Christopher Chen及其同事研发出的一种设计被广泛使用。这种芯片采用弹性材料PDMS制作，在基底上排布着柔性微柱阵列，类似于牙刷上的刷毛。微柱顶端使用ECM蛋白修饰，帮助细胞粘附。Chen实验室的前博士后Jianping Fu说：“它们基本上就像迷你弹簧，通过测量微柱的偏斜，人们能够识别和测量细胞施加在单个微柱上的力。” 目前他在密歇根大学安娜堡分校使用类似的设备研究人类干细胞。

实验阵列中的可弯曲微柱，它们可以被测量，并与细胞的蛋白骨架进行比较。

Reprinted from H. Van Hoorn et al. Nano Lett.14, 4257–4262 (2014).

微柱阵列数据比TFM的实验结果更容易解读，需要的计算分析也更少，而且这种芯片的制作是相当简单的。它们也可以与荧光显微镜联用，这有利于对产生细胞力的活动进行分子尺度的研究。然而，这些阵列也在细胞和其基底的交互作用当中强加了一个特殊的但是非自然的模式——由微柱的分布和尺寸决定，这可能会与细胞在活体中的行为存在偏离。

研究人员还可以通过调整微柱阵列的设计来定制细胞培养表面。较短、较粗的微柱更为坚硬且不容易弯曲，反之，较长、较细的微柱则更为柔软，对力有更为敏感的响应。这种微柱表面刚性的改变能够引起不容忽视的细胞骨架重组 — 细胞骨架指的是形成细胞的物理基础结构并帮助其传递响应力的蛋白质网络。这反过来又可以影响到细胞的增殖、运动和成熟。

例如，Fu已经发现了表面刚性与成体干细胞分化之间的一种关系。如果干细胞被种在难以弯曲的树桩样微柱上，它们将分化成骨细胞；但是如果将其种在较高的微柱上，它们则有较大的倾向分化为脂肪细胞。通过精确地调整设计，Fu的团队甚至能够开发出一种非常有利于使人体胚胎干细胞发育成为功能性脊髓运动神经元的细胞培养系统。

轻轻一拉

其他的研究人员正在使用分子传感器测量由蛋白或蛋白复合物施加的力，分子传感器会对张力的小规模改变产生响应，从而产生荧光信号。这种传感器大都是基于福斯特共振能量转移 （FRET，又名荧光共振能量转移） 。FRET指的是当一个荧光分子或荧光团与另一个荧光分子或荧光团物理距离相近时，一个激发另一个的现象。

迁移中的细胞施加的牵引力图。

Nikolce Gjorevski

Grashoff在弗吉尼亚大学生物医学工程师Martin Schwartz的实验室担任博士后期间，和同事们一起开发了第一批基于FRET的张力传感器之一，此项成果发表在了他们2010年的文章中。Grashoff说：“我们的想法是，我们可以用这种在蜘蛛丝中发现的非常有弹性的蛋白质将两个荧光团彼此连接起来。当有机械张力时，它会伸长，你可以测量减弱的FRET信号。”静止时，蛛丝蛋白形成一个紧凑的线圈，但是轻轻一拉可以拉伸弹簧，并将两个荧光团分开。

为了进行概念验证，Grashoff和Schwartz将他们的传感器集成到一种名为黏着斑蛋白的蛋白质中，黏着斑蛋白是黏着斑复合物的一种组分，形成ECM和细胞骨架之间的桥梁。当他们在细胞中表达传感器蛋白时，他们观察到，在细胞迁移过程中，随着黏着斑的组装和解聚，黏着斑蛋白受到了皮牛顿级的力。

原则上，FRET传感器可以被插入到各种蛋白质中，从而获得其他方法难以收集到的测量结果。例如，几乎很少有工具能够定量测量细胞在组织中如何互相推拉，但是斯坦福大学的化学工程师Alexander Dunn及同事通过将Grashoff和Schwartz的FRET传感器整合到上皮钙粘蛋白中，可以测量这些力。

传感器也可以围绕其他连接蛋白设置，让研究人员可以微调传感器的灵敏度。Grashoff指出，他的FRET传感器能够选择性地响应1-12皮牛顿的力。但他补充说，传感器仍有改进空间，因为细胞内蛋白质可能会经受高达20-30 皮牛顿的力。

但是设计和校验这种传感器的工作量很大，而且除了力检测以外，传感器可能会由于其它原因 （如降解） 而停止工作。对FRET信号的解读也具有挑战性，它需要仔细测量以消除假阳性。而且，将大体积的传感器插入到蛋白中也会产生一定后果，因为蛋白的功能对其结构有很强的依赖性。“你难以充分预测它的工作状况，”Grashoff说，“你干扰了蛋白，这可能不是个大问题，但你必须得知道这个干扰程度。”

其他研究小组使用不需要插入蛋白质的传感器来测量细胞外的力。Khalid Salaita是佐治亚州亚特兰大埃默里大学的生物物理学家，他的小组研发了几种这样的探针，探针的一端固定在固体表面上，例如载玻片，另一端显示与相关细胞表面蛋白结合的生物分子。Salaita在两端之间放置了各种各样的接头，用于响应不同程度的力。Salaita说：“聚乙二醇聚合物就像湿的意大利细面条，无规则的卷曲能够被拉伸，而DNA具有固定的二级结构。”

他的小组还使用了源于一种名为titin的蛋白质的接头，titin能够在肌肉中产生弹性反冲。Salaita说：“这是一个自然形成的弹簧，能够承受更大的力。”这些基于titin的传感器足够强大，可用于测量细胞通过整联蛋白对其所处的微环境施加的强大的拉力，整联蛋白是黏着斑的组成成分，黏着斑能够产生数十皮牛顿的力 — 足以撕开较弱的DNA双链体和基于聚合物的传感器。Salaita说：“整联蛋白基本上是一种强力抓钩，可以锚定细胞并施加广泛的力。”

力所能及

科学家能够测量细胞内的力，这件事本身就很了不起。由此得到的信息可能会使我们在临床上受益。Salaita认为，在单细胞水平测量力的试验或有助于科学家们发现能直接对肿瘤进展物理机制进行干预的更安全的药物。他说：“肿瘤细胞的迁移和侵犯是最致命的，如果你可以关闭这个机械过程，而且让药物无细胞毒性，那将是一个更精准的工具。”

然而，许多的生物学问题需要在组织或器官尺度上进行探索。Nelson说：“你很难通过分离的细胞去详细预测组织，单个细胞之间的连接对组织中的力的产生和传递似乎是必不可少的。”

Nelson在许多实验中都使用工程化上皮组织，为研究器官形成所涉及的力提供了可控的、可重现的模型。其他小组使用干细胞产生特定组织；例如，Pruitt使用源自干细胞的心肌细胞来研究心脏病的力学生物学效应。 她说：“我们现在有很多工具，让我们有可能从人类细胞产生出心肌细胞并加以应用，并在单细胞和微组织中测量力、位移和伸展情况。”

科学家们终于能够探索Thompson百年假说的含义了，Nelson为此而感到激动。她说：“我认为整个领域正在表明，机械力能够在组织发育最终形成的形式中发挥重要作用，与被激活的基因相比，如果不是机械力更重要，那起码也是同等重要。”

然而，人们还是需要更多的工具。大多数的力测量实验仍然是耗时的，这就限制了其实用性，例如药物筛选这种需要对大量细胞进行平行分析的应用。Fabry组正在开发能够自动执行和加速TFM实验的方法。他说：“我们想同时测量三维组织中成百上千个细胞的响应。”

测量生物体中的细胞力也是一项重大的挑战。FRET传感器提供了一种解决方案，加州大学圣塔芭芭拉分校的机械工程师Otger Campàs和他的同事们最近设计了另外一种方案。他的小组将荧光标记的油滴注射到生物体内，修饰油滴的蛋白可以连接至细胞表面。通过记录这些液滴在细胞之间的空间中的变形情况，他们可以通过计算得到细胞施加在液滴上的三维的力。

也许最根本的是需要一些实验技术让科学家们能够更精确地操纵力响应分子。例如，使单个黏着斑失活的能力 （类似于遗传学家敲除单个基因） ，能够揭示分子力的时间和空间分布如何改变它们对细胞的影响。Nelson说：“这可以让我们直接回答很多我们现在可以说是在绕着圈子解决的问题。” ⓝ

Nature|doi:10.1038/nature.2017.21961

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