刘翠翠
1
，殷嘉妮
1
，蒋斯明
1
，邵阳
1,2*
（1. 南京世和基因生物技术股份有限公司，江苏 南京 210032; 2. 南京医科大学公共卫生学院，江苏 南京 210029）
[摘要]
胆管癌是一种罕见、异质性高且预后不良的恶性肿瘤，近年来肝内胆管癌的发病率呈上升趋势，由于其高度的异质性，胆管癌的治疗方法有限。近年来基因组学的研究发现接近一半的胆管癌患者携带潜在治疗靶点，其中成纤维细胞生长因子受体（FGFR）通路的激活，尤其是FGFR2 基因的融合，是较常见的肝内胆管癌的发病机制。多种 FGFR 抑制剂的临床试验结果为携带FGFR2 基因融合晚期胆管癌患者带来新的希望。通过对胆管癌中FGFR 基因变异图谱及检测方法和伴随诊断进行综述，旨在探讨FGFR2 融合在胆管癌中的驱动作用以及靶向治疗潜力。
胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是一种罕见且致死率高的恶性肿瘤，该病的全球发病率逐年上升。对于可手术患者，根治性术后，约 35% 患者在 2 年内会复发 [1]。绝大多数患者在确诊时，疾病已经发展到了转移性且不可手术的地步 [2-3]。晚期转移性 CCA 患者的标准治疗方案为吉西他滨联合顺铂，但是其 5 年生存率仍小于 2%，且二线及末线治疗手段有限 [4]。因此，对于 CCA 的治疗，急需新的治疗方案和方法。
基因图谱研究显示，近一半的 CCA 携带潜在治疗靶点，主要包括的激酶基因有成纤维细胞生长因子受体基因（fibroblast growth factor receptor，FGFR1/2/3）， 磷 脂 酰 肌 醇-3-激酶亚基基因（phosphatidylino-sitol-3-kinase，PIK3CA）、 间 变性淋巴瘤激酶基因（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、表皮生长因子受体基因（epidermal growthfactor receptor，EGFR）、表皮生长因子受体 2 基因（ERBB2）、小鼠肉瘤病毒癌基因同源物 B1（murinesarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）、Kirsten 大 鼠 肉 瘤 病 毒 癌 基 因（Kirsten rat sarcomaviral oncogene，KRAS）、母体抗生物皮肤生长因子同源蛋白 4 基 因（mothers against decapentaplegic homolog 4，SMAD4）、 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 1 基 因（isocitrate dehydrogenases 1，IDH1）、IDH2、 细胞周期素基因（cyclinD，CCND1）、CCND3、鼠双微体 2 基因（murine double minute 2，MDM2），以及抑癌基因肿瘤蛋白 p53（tumor proteinp53，TP53）、 乳 腺 癌 易 感 基 因（breast cancersusceptibility genes，BRCA1/2）[5-6]。根据肿瘤在胆道中的位置，可以分为肝内胆管癌（intrahepaticcholangiocarcinoma，ICC）和肝外胆管癌 (extrahepaticcholangiocarcinoma，ECC )， 其 中，ICC 的发生频率占 CCA 发病率的 5% ~ 20% [7-8]。ICC 和 ECC 两者的发病率、危险因素、临床表现均不相同 [9]，同样的，两者基因突变图谱也不相同：ICC 中，常见突变基因为 IDH1（30%）、AT 丰富结合域 1A（AT-richinteraction domain 1A，ARID1A，23%）、BRCA1 相关蛋白 1 基因（BRCA1 associated protein-1，BAP1，20%) 以及 TP53（20%）和 FGFR2 融合基因（14%）；ECC 中常见突变基因为 KRAS（40%）、SMAD4（30%）和丝氨酸/苏氨酸激酶 11 基因（serine/threonine kinase11，STK11，11%）（见图 1）。在 CCA 常见的突变基因中，TP53 常与细胞周期依赖性激酶抑制基因（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）、CDKN2B 突变共发生，而 SMAD4 和 KRAS 也存在共突变现象。另外，超出解剖位置上的差异，不同突变基因存在互斥的现象，比如 TP53 和 IDH1、IDH1 和 KRAS、TP53 和 BAP1、IDH1 和 FGFR2 [10]。
针对以上靶点的抑制剂有可能成为 CCA 的潜在治疗方法。2020 美国临床肿瘤学会胃肠道肿瘤研讨会（ASCO GI）的一项研究，对 212 例胆道肿瘤患者进行 FoundationOne CDx 检测，筛选到 68 例具有可用药靶点的患者接受靶向治疗，与未接受靶向治疗的患者相比，中位无进展生存期（medianprogression-free survival，mPFS）分别为 6.2 和 2.8个月 [11]，具有显著的临床效果。
FGFR 是 CCA 靶向治疗中重要靶点之一。据报道约 20% 的 ICC 病例中存在 FGFR 通路的异常激活 [12-13]。FGFR 蛋白主要包括 FGFR1、FGFR2、FGFR3 和 FGFR4 4 个亚型，均具有与配体结合的胞外区、跨膜区和受体磷酸化的胞内区的结构特点，是酪氨酸激酶信号通路的一部分，参与细胞增殖和分化。FGFR 分子改变包括胞外结构域和激酶结构域对应的点突变、扩增以及 FGFR 基因融合，都可导致 FGFR 信号通路异常激活（见图 2），促进细胞增殖、新血管生成、侵袭、转移、抗凋亡等。
1 胆管癌中FGFR 基因变异图谱
在 CCA 中，FGFR 变异的占比约为 7%，变异类型包括融合（3.5%）、扩增（2.6%）、点突变或插入缺失（0.9%）。不同 FGFR 基因在 CCA 中的变异频率有明显差异（见表 1）。其中，FGFR2 是 FGFR家族中最高频的 CCA 相关变异基因，占 6.1% [5]；其变异形式以融合为主。其他 FGFR 基因的变异在CCA 中也有报道，但是发生率相对较低 [10, 14-15]。
传统融合检测与高通量测序技术的发展揭示了 FGFR2 在 CCA 中的融合图谱。研究发现，FGFR2 融合几乎仅发生在 ICC 中，发生频率为5% ~ 17% [6,10,14,16-19]。Graham 等 [17] 应用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH），发现在 156 例胆道肿瘤患者中有 13 例携带 FGFR2融 合， 其 中 12 例 为 ICC 患 者（12/96，13%）、1 例为胆管内乳头状肿瘤。Arai 等 [16] 应用实时荧光定量聚合酶链式反应技术（quantitative real timepolymerase chain reaction，qRT-PCR）联合一代桑格（Sanger）测序验证 FGFR2 融合在 CCA 中的频率是 8.8%（9/102)，并且仅在 ICC 中发生的频率为13.6%（9/66）。另一方面，利用二代测序技术（nextgeneration sequencing，NGS）发现，FGFR 的融合断点多位于 18 号外显子，与伴侣基因的 3' 端结合，但是其融合伴侣繁富多样，同时，FGFR3 的融合在 CCA 中也有案例报道 [15]。一项国际多中心研究 [15]，对来自 10 个国家的 489 例 CCA 样本进行了多组学分析（全基因组、靶向/外显子组、转录组、DNA 甲基化组），定义了 4 个 CCA 亚群，其中一个亚组富集 FGFR 基因变异，包括 10 例点突变、3 例插入缺失、1 例扩增以及多种 FGFR2 融合形式（FGFR2-BICC1，FGFR2-STK26，FGFR2-TBC1D1和 FGFR2-WAC），并首次在 CCA 中检测到 FGFR3融合（FGFR3-TACC3）。在该研究中，还观察到FGFR2 基因 3' 非翻译区（3' untranslated region，3'UTR）的丢失现象，这可能是 FGFR2 激活的新的潜在机制。另外，Nakamura 等 [6] 对 260 例 CCA 患者进行了全外显子测序和转录组测序，包括 145 例ICC、86 例 ECC 和 29 例胆囊癌。在 6 例 ICC（6/109，5.5%）中鉴定了 4 种 FGFR2 融 合 伴 侣：FGFR2-BICC1（3/6）、FGFR2-AHCYL1（1/6）、FGFR2-KCTD1（1/6）和 FGFR2-TXLNA（1/6）。除了全基因组全外显子检测，大量针对 FGFR 融合图谱的研究是基于 NGS 大 panel 基因检测。一项针对 195 例CCA 样本（ICC，158 例；ECC，27 例）的研究 [10]，基于纪念斯隆凯特琳癌症研究中心癌症基因检测分析平台（MSK-IMPACT）的 410 个基因的大 panel，在 19 例 ICC（12%）患者中检测到 16 种 FGFR2 融合形式，常见融合伴侣为 BICC1（6/16，37.5%）和KIAA1217（2/16，12.5%），其中 BICC1 包含多种融合形式。其他融合伴侣异质性较高，都分别以个例形式发生。另一项针对 75 例 CCA 患者（ICC，55 例；ECC，20 例）的图谱研究 [14] 检测了 236 个癌症相关基因，在 4 例 ICC（7.3%）中检测到 3 种FGFR2 融合，融合伴侣分别是 KIAA1598、NOL4 和PARK。还有一项小样本研究 [18]，针对 28 例 ICC 患者做了 182 个基因的靶向检测，发现 4 例 FGFR2融合（14%），融合伴侣包括 KIAA1598、BICC1 和TACC3。FIGHT-202 Ⅱ期临床试验 [20] 入组了 107 例FGFR2 融合胆管癌患者（105 例 ICC、1 例 ECC、1 例亚型不明确），有 56 种 FGFR2 融合类型，其中 75% 融合类型为患者个体所特有，常见融合伴侣为 BICC1，占比为 29%。其他较高频融合伴侣包括KIAA1217（4%）、AHCYL1（3%）和 SLMAP（2%），剩余融合伴侣频率大多为 1% （见表 2）。
另外，一项来自日本的研究结果显示，4.8% 的肝门旁胆管癌也携带 FGFR2 融合，而 ICC 中 FGFR2融合发生频率为 7.7%[21]，这可能与肝门和 ICC 没有清晰的解剖分类有关，但这也显示了 FGFR2 融合在胆管癌中变异的复杂性。后续期待更多的研究揭示FGFR2 融合在胆管癌不同亚型中的发生频率。
2 靶向治疗在胆管癌中的应用
目前针对 CCA 的多种 FGFR 抑制剂处于临床开发的各个阶段，并在难治晚期 FGFR 融合或变异阳性患者中展现了一定的疗效（见表 3）。其 中， Ⅱ 期 FIGHT-202 的 试 验 结 果 显 示， 培 米替 尼（pemigatinib，Pemazyre®）用于治疗晚期经治 FGFR2 基因融合阳性的 CCA 患者，客观缓解率（objective response rate，ORR）高达 35.5%，mPFS 和 中 位 总 生 存 期（median overall survival，mOS）分别长达 6.9 和 21.1 个月。基于这项研究的结果，美国 FDA 批准培米替尼作为首个用于治疗携带 FGFR2 基因融合晚期胆管癌成人患者的靶向药物，并批准 FoundationOne CDx 作为培米替尼的伴随诊断产品。同时，Ⅲ期随机对照研究 FIGHT-302正在开展，探究培米替尼一线治疗携带 FGFR2 融合的 CCA 的疗效 [20]。此外，多个 FGFR 抑制剂都在 CCA 中初现疗效 （见表 3），这些研究均显示了FGFR 抑制剂以及检测 FGFR 融合及变异在 CCA 治疗中的应用价值。
另 外，IDH1 在 ICC 和 ECC 中的突变频率分别约为 13% 和 4%[22-23]。Ⅲ 期、 多 中 心、 随 机ClarIDHy 试 验 结 果 显 示：IDH 抑制剂艾伏尼布（ivosidenib）治疗接受过一线以上治疗的 IDH1 突变的 CCA 患者的 mPFS 有所改善，对比安慰剂，分别是 2.7 和 1.4 个月，疾病控制率（disease controlrate，DCR）分别是 53% 和 28%[24]。另有 2 款 IDH抑制剂达沙替尼（dasatinib）和 AG-881（vorasidenib）目前正处于临床研发阶段。研究显示，神经营养素受体络氨酸激酶（neurotrophic receptor kinase，NTRK）在 ICC 中的突变频率约为 3.5%[18]，恩曲替尼和拉罗替尼在 CCA 中也显示出一定治疗疗效 [25-26]。BRAF 突变（最常见为 V600E 突变）在 ICC 中的发生频率为 3% ~ 22%[27]， 在 8 例 BRAF V600E 突变接受威罗菲尼（vemurafenib）治疗的胆管癌患者中，1 例表现为部分缓解（partial response，PR），4 例 为 病 情 稳 定（stable disease，SD）[28]。ROAR篮子试验的初步结果显示，达拉非尼联合曲美替尼在 BRAF V600E CCA 队列中显示出一定疗效 [29]。BRCA1/2 在 ICC 中的突变频率为 1% ~ 4%[6]。一项多中心回顾性研究显示，4 例携带种系或体系BRCA1/2 突变的 CCA 患者接受聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂治疗后，其中 1 例患者 PFS 长达 42.6 个月 [30]。其他 CCA 靶标如间质表皮转化因子（mesenchymalto epithelial transition factor，MET）[31]、CDKN2A[32]等目前未显示出治疗前景。
3 FGFR 基因检测方法及伴随诊断
伴随诊断是体外诊断的一种，是能够为患者提供特定药物应用的安全性与有效性信息的体外诊断试剂，能帮助医疗工作者评估不同患者的受益程度以及潜在不良反应与风险，并确定最终治疗方案 [36]。在肿瘤治疗中，伴随诊断与精准医疗密不可分，用于筛选靶向治疗获益人群、监测治疗反应 [37]。针对FGFR 基因融合及其他变异的检测不但可以用于筛选抑制剂获益人群，与患者的预后以及肿瘤的惰性状态也相关。比如，携带 FGFR 融合的患者中位总体生存期（median overall survival，mOS）显著高于 FGFR野生型患者 [38-39]，FGFR 融合患者肿瘤处于相对惰性状态 [14]。因此有必要在 CCA 治疗，尤其是靶向治疗中引入 FGFR 基因检测，目前可用于 FGFR 基因检测的技术主要有免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）/FISH、qRT-PCR、NGS。
IHC/FISH 技术是传统的融合检测方式。IHC 是基于抗体对于组织细胞中抗原的特异性识别和结合，通过抗体上显色反应对于细胞中抗原进行定位、定性及定量的技术。IHC 并非直接检测肿瘤细胞的遗传学变化，而是检测 FGFR 蛋白，通过表达量来判断阳性与否。然而，融合不一定会引起蛋白水平的上升，导致假阴性的可能 [40]。FISH 技术是在待测基因两端设计荧光探针，通过观察两端探针分离程度判定基因融合情况。FISH 的结果判读依赖经过严格培训的病理医生，且活检标本肿瘤细胞常达不到要求。同时，IHC 和 FISH 不能确定融合断点的位置、具体融合伴侣等信息，无法发现新的融合伴侣，并且通量低，通常一次检测 1 个基因的融合。但是基于传统检测技术操作简便、周期短，在特定融合基因的检测中广泛应用。由于 FGFR 融合伴侣的复杂性，传统检测技术 IHC/FISH 用于检测 FGFR 融合局限性较大。所以，传统检测方法中，往往只有FISH 技术应用于验证高通量测序鉴定的 FGFR 融合结果 [16]。
qRT-PCR 技术利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，从而对起始模板进行定性、定量分析。荧光标记方法有染料法和 Taqman 探针法，Taqman 探针法适合目标区域变异检测。在泌尿上皮癌中，FDA 批准 therascreen® FGFR RGQ RT-PCR Kit（Qiagen) 作为厄达替尼的伴随诊断试剂盒，该试剂盒基于 qRTPCR 技术定性检测患者肿瘤组织中的 FGFR 基因变 异， 包 括 4 种 FGFR3 点突变和 3 种 FGFR3 融合 及 2 种 FGFR2 融 合（FGFR2-BICC1、FGFR2-CASP7）。qRT-PCR 技术操作简单、周期短、相对敏感性较高，然而该方法应用于 CCA 中 FGFR 融合的检测存在明显不足：1）qRT-PCR 探针根据已知突变位点设计，仅能检测已知突变，对未知突变检出不足；2）检测样本为核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），易降解，对样本质量和检测环境要求较高；3）CCA 中基因融合伴侣异质性高，多为未知融合，因此该技术在 CCA 的临床应用中有一定局限性。但是该技术多用于验证 NGS 鉴定的融合形式，比如Wu 等 [13] 应用 qRT-PCR 技术验证了 4 个通过转录组测序（RNA-seq）鉴定的 FGFR2 融合形式。
NGS 高通量测序技术，典型特点是读长短、通量高、准确性高，可以同时检测多个突变、多种变异形式，尤其是在鉴定基因融合伴侣方面具有显著优势，不仅可以揭示罕见新型融合，并能清晰给出融合伴侣和断点信息，辅助判断融合是否有效。有分析显示约 10 000 种基因融合中的 90% 通过 NGS技术发现鉴定 [41]。NGS 技术主要分为基于 DNA和基于 RNA 的 2 种 融 合 检 测 方 式。基 于 DNA样本的 NGS 包 括 全 基 因 组 测 序（whole genomesequencing，WGS）、全外显子测序（whole exomesequencing，WES）、目标区域测序，综合考虑检测成本、分析复杂性及检测周期等因素，临床应用中一般采用目标区域测序。另一方面， 基于 RNA样本的 NGS 包括全部信使 RNA（messenger RNA，mRNA）测序和目标 mRNA 测序，前者检测范围全面，后者检测更具针对性，RNA-seq 克服了基因组panel 检测内含子覆盖不足的问题，也解决了基因组突变，转录组不一定表达的问题，在外显子跳跃和可变剪切方面更具优势，可有效补充基因组基因融合检测。针对全部 mRNA 测序，在 CCA 中鉴定了多种 FGFR2 融合形式 [6, 13, 15]，应用靶向 mRNA 测序，研究者也检测到多种 FGFR 融合形式 [21]。在血液系统肿瘤中，联合 DNA-seq 和 RNA-seq 可有效检测的基因突变、拷贝数变异、基因融合等多种变异形式 [42]，因此在实体瘤融合基因检测方面也可以尝试两者联合检测。另外，一项靶向检测实体瘤中 93 种激酶及转录因子基因融合的 RNA-seq 技术，在敏感性和特异性方面分别可达 93.3% 和 100% [43]。目前，Foundation One CDx 是 CCA 目前唯一获批的伴随诊断，中国还没有针对 FGFR 基因检测的 NGS 产品获批。FoundationOne CDx 获美国 FDA 批准作为培米替尼的伴随诊断显示出 NGS 技术在基因融合检测中的重要作用，该伴随诊断是针对 DNA 测序。
