近日，曹雪涛院士在Hepatology上发表CircRNA有望作为肝癌发生的肿瘤标记物的研究。该课题组先在肝癌组织中发现circRNA （hsa_circRNA_0007874/hsa_circRNA_104135）也称为circMTO1。（回复170710可下载文献，一月有效）
根据ceRNA的经典法则，曹课题组采用RIP技术在肝癌细胞中检测到与其结合的miRNA称为miR-9；通过在肝癌细胞中沉默circMTO1检测到p21，p21同时也是致瘤性miR-9的靶向mRNA。那么就跟着小编重温曹雪涛院士的经典之路，看其如何更丰富和精彩的验证。
在这里不讲战术，只谈曹雪涛院士的实验方法。为了方便大家理解，在这里先呈现CircRNA的经典发挥作用的模式图，图中说明CircRNA可以作为ceRNA（竞争性RNA）或者称为microRNA Sponge 与miRNA相结合，从而释放miRNA的target mRNA。
1.首先利用CircRNA microArray分析7组对照组和实验组肝癌组织中发现差异circMTO1，并且观察其在肿瘤预后病人体内的表达。
采用队列研究在116个肝癌病人组织中采取ISH分析，结果表明circMTO1在肿瘤预后病人中的表达水平较正常组是下降的。
2.因为CircRNA是作为ceRNA调节基因的表达情况，所以寻找miRNA则是重中之重。
曹课题组采用MiRanda Program 进行预测，在肝癌细胞中发现了99个相关性的miRNA, 并且在预测的miRNA中采用circMTO1探针技术进行RIP实验富集到了miR-9。
FISH技术在肝癌细胞中分析 circMTO1与miR-9 共同定位在细胞浆中，且与对照组相比，肝癌细胞的数目较少。
3.课题组在8种细胞中进一步做了circMTO1与miR-9的表达水平的鉴定，选择敏感HepG2 和SMMC-7721 细胞系做敲除circMTO1的表达；选择敏感SK-Hep1 和QGY-7701细胞系做过表达circMTO1的设计。
4.circMTO1敲除后促进肝癌细胞增长和细胞浸润以及细胞凋亡减少。
过表达circMTO1后，细胞增殖减少，细胞浸润减少以及细胞凋亡增加。
5.寻找circMTO1发挥生物学作用的机制。
circMTO1敲除后和过表达后观察p21的RNA水平和蛋白的表达水平分别是上升和下降。
6.为了证明circMTO1 能够抑制肿瘤组织的生长是通过与miR9结合，从而释放P21,使p21的表达水平增高。
曹课题组采取了miR9的阻断剂，miR9的阻断剂可以使p21的mRNA水平和蛋白表达水平下降；可以阻断沉默的circMTO1阻止细胞的增殖和浸润。
7.最后，曹课题组锦上添花的是在小鼠体内进行了验证-沉默circMTO1 后，肿瘤生长的速度加快。
选择HCC-bearing裸鼠，在皮下做人类肝癌组织的成瘤实验，在瘤体内持续注射两周的cholesterol-conjugated circMTO1 siRNAs，观察到肿瘤生长的速度加快，而且AFP指数增高；circMTO1和P21的表达水平是下降的。
那么分析完文章后，我带着大家总结一下本文所用的实验技术，首先利用microArray分析出circRNA-circMTO1；用MiRanda Program预测出miR9,并且用RIP和FISH技术进行验证circMTO1和miR9的关系；通过过表达和沉默siRNA观察肝癌细胞的细胞增殖和细胞浸润以及细胞凋亡的情况；使用miR9阻断剂观察对mRNA P21的影响变化情况；最后用在体实验进行佐证，最终证明circMTO1是肝癌的潜在标记物。
文章到此就结束了，如果你也有这方面的课题，可以熟悉曹雪涛院士的经典的实验方法，做最有利的证明。
