Angew. Chem. Int. Ed. | 利用基因编码的β-内酰胺氨基酸设计细胞穿透抗体

吕华课题组 · 公众号 · · 2025-01-14 15:00

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大家好，今天给大家分享一篇发表在 Angew. Chem. Int. Ed. 上的文章，题为： Design of Cell-Penetrating Domain Antibodies via a Genetically Encoded β-Lactam Amino Acid 。本文的通讯作者是来自美国纽约州立大学布法罗分校的 Qing Lin 。

自 1975 年 Köhler 和 Milstein 发现单克隆抗体以来，抗体技术已经彻底改变了生物医学研究领域，并为癌症和传染病的治疗提供了强大的治疗手段。然而，传统抗体难以穿透细胞膜，限制了其在细胞内信号传导研究中的应用。单域抗体因其小尺寸和稳定的免疫球蛋白折叠，成为潜在的细胞内靶标抗体。因此，开发单域抗体相关的细胞穿透策略对于发展基于蛋白质的生物疗法至关重要。

本文作者提出了一种结合正交交联和表面超电荷化的策略，设计合成了能够穿透细胞并具有生物活性的 monobody 。他们通过遗传密码扩展的方法，将一种新的具有环张力的亲电氨基酸——β - 内酰胺赖氨酸（ BeLaK ），位点特异性地掺入 monobody 中。 BeLaK 能够与邻近的赖氨酸发生自发的邻近驱动交联，形成稳定的蛋白质“订书钉”，类似于细菌菌毛和粘附蛋白中发现的天然非二硫交联剂（图 1 ）。这种交联增强了 monobody 的热稳定性和细胞摄取能力，并促进内体逃逸，从而有效抑制了细胞内信号通路。

图 1. 单域抗体增强细胞通透性的策略示意图。

首先，作者展示了 BeLaK 的结构设计，并将它特异性掺入到超折叠绿色荧光蛋白（ sfGFP ）中。通过荧光强度、蛋白质凝胶电泳、质谱等方式证明了它的成功掺入（图 2 ）。

图 2. β - 内酰胺氨基酸的设计及其在 sfGFP 中的位点特异性结合。

接着，作者通过 GST 二聚体模型实验，验证了 BeLaK 的交联反应性和位点选择性。在 GST 二聚体的结构模型，其中一个单体的 BeLaK-52 位点（红色标记）与另一个单体的 Lys-92 位点（蓝色标记）之间的距离约为 7.2 Å ，是可能的交联位点。更进一步地，作者将 Lys-92 突变为 Ser 、 Cys 、 Thr 、 Tyr 、 His 时，交联效率就大大降低了（图 3 ）。

图 3. GST 二聚体中的 BeLaK 交联反应。

随后，作者基于 NSa1 monobody 构建了不同的超电荷变体（增加不同的 Lys 数目，同时掺入 BocK 或 BeLaK ），并测量了他们的 T _m 值。结果表明，野生型 NSa1 的 T _m 值为 80 ° C 。对于 +6 、 +8 和 +11 电荷的突变体， BocK 和 BeLaK 掺入的 Tm 值差异不显著。然而，对于 +18 电荷的突变体， BeLaK 掺入的 T _m 值比 BocK 掺入的 Tm 值高出 8 ° C ，显示出正交交联对高电荷突变体热稳定性的显著提升（图 4 ）。

图 4. NSa1 突变体的热稳定性。

最后，作者探究了改造后 NSa1 monobody 的细胞摄取能和生物活性。结果表明，随着电荷数（ Lys 数目）的增加，细胞摄取能力也相应增强。此外，对于 +11 和 +18 电荷的变体，交联状态（ BeLaK ）相比非交联状态（ BocK ）显示出更好的递送效果，表明正交交联策略显著提高了 monobody 的细胞摄取效率。作者还将不同浓度的 NSa1(+18)-BeLaK 加入到表达 SHP2 的 KYSE-520 食管癌细胞系中，孵育后通过蛋白质印迹分析 ERK 的磷酸化水平，以评估 monobody 对 SHP2 信号通路的抑制能力。 NSa1(+18)-BeLaK 以浓度依赖的方式抑制了 ERK 的磷酸化，其效果与已知的小分子抑制剂 SHP099 相似。

图 5. 超电荷化 NSa1 的细胞摄取和活性。

综上所述，本研究通过表面超电荷化结合 β- 内酰胺赖氨酸（ BeLaK ）正交交联策略，成功开发出了一种能够穿透细胞并具有生物活性的 monobody 。 BeLaK 的位点特异性掺入和自发交联显著提高了 monobody 的热稳定性和细胞摄取能力，为开发针对细胞内靶标的生物疗法提供了新的思路。

作者 : HYH 审校 : QJC

DOI: 10.1002/anie.202424076

Link: https://doi.org/10.1002/anie.202424076