Angew Chem：酶促反应网络驱动的聚合诱导的瞬时凝聚

图2. 通过BioATRP合成PDMAEMA的方案

要点一 ：作者通过生物催化原子转移自由基聚合（BioATRP）方法使用辣根过氧化物酶（HRP）作为催化剂，控制聚合反应，合成了聚2-（二甲氨基）甲基丙烯酸乙酯（PDMAEMA）。两个不同批次合成的聚合物P1和P2的分子量分布图，表明它们具有20-40 kDa的分子量，聚合度约为200，分散度低（~1.1）。PDMAEMA与ATP和ADP的浊度滴定展示了PDMAEMA与ATP和ADP的相互作用，PDMAEMA 与 ATP 的复合物在较低浓度下形成的浊度，而与 ADP 的复合物则需要更高的浓度，表明ATP比ADP更有效地与PDMAEMA形成复合凝聚物。PDMAEMA与ATP形成的球形复合凝聚物的CLSM图像，证实了复合凝聚物的形成。荧光漂白恢复实验（FRAP）表明了PDMAEMA与ATP复合凝聚物的荧光恢复动力学，进一步证实了复合凝聚物的形成和可逆性。

图3. 单酶诱导的瞬时凝聚

要点二 ：作者通过在体系中加入添加尿素和乙酯酶来调节pH值，酯酶通过将乙酸乙酯转化为乙酸和乙醇来降低pH值，而脲酶通过催化尿素水解产生氨来提高pH值。在乙酸缓冲液中（pH 4），聚合物与ATP结合形成凝聚体，表现为高浊度。加入尿素会生成氨，提高pH值，导致聚合物去质子化，从而引起凝聚体溶解。相反，加入酯酶和乙酸乙酯会在原位产生乙酸，降低pH值，从而重新诱导凝聚和浊度。ALP催化ATP的水解，从而降低ATP的浓度。实验中，将不同浓度的ALP（2.5、5和10 U/mL）加入含有PDMAEMA和ATP的溶液中。没有ATP时，吸光度或浊度没有变化，表明没有凝聚。加入5 mM ATP后，开始凝聚，导致浊度增加。随着时间的推移，由于ALP催化ATP的水解，观察到凝聚体溶解。增加ALP单位会加速溶解的开始，表明凝聚的动态调节。接下来作者展示了使用酶反应网络（ERN）来控制凝聚过程。通过引入磷酸肌酸激酶（CPK）和己糖激酶（HK）及其底物，实现了ATP的动态合成和分解，从而控制凝聚和溶解。

图4. BioATRP和ERN驱动的共凝聚过程

要点三 ：在凝聚体中CPK-488、BSA-TAMRA、HK-647和GOx-647的共定位。所有测试的蛋白质/酶都被共凝聚体均匀地捕获，表明它们都位于共凝聚体内部，并从内部进行反应，确保对液滴的快速和高效作用。生物PIC过程中HRP催化单体通过BioATRP聚合，单体和聚合物反应后的浊度以及过滤后的聚合物浊度变化来证明。ERN-PIC过程中HRP通过BioATRP催化单体聚合，在ATP存在下发生共凝聚，随后通过ALP介导的ATP水解到Pi发生溶解。在ALP对照实验中，浊度会因APL的添加与否发生变化，在ALP存在的情况下，浊度先增加后减少，表明ERN-PIC过程的发生。生物PIC共凝聚体无法摄取在共凝聚后添加的标记蛋白质，而小分子染料（如resorufin、TAMRA和Nile Red）可以进入共凝聚体。这表明共凝聚体具有高度选择性的渗透性，可以根据制备方法排除或摄取蛋白质。