导 读： 季节性流感病毒感染每年在全球范围内造成重大疾病和经济负担，仅 2022 - 2023 年美国就有超过三千万的流感病例，经济损失约 250 亿美元。虽然已经有季节性流感疫苗，但由于其研发、制备周期较长，以及流感病毒的抗原性漂移，使得疫苗的有效性并不高。全球在每年仍可能有 25 - 50 万人死于流感相关疾病。目前，编码病毒血凝素 ( H emagglutinin, HA) 和神经氨酸酶 ( Neuraminidase , NA) 两种糖蛋白的 mRNA 是非常有力的新一代流感疫苗，其具备多重保护性免疫反应，且具有持久性。然而，单独递送两种抗原会使得生产复杂化、成本增加。

2024 年 10 月 8 日， 杜克大学 Ni cholas S Heaton 携手 mRNA 诺奖得主 Drew Weissman ，在 Nature Communications 上发表题目为 “Improved influenza vaccine responses after expression of multiple viral glycoproteins from a single mRNA” 的研究型文章。 文章显示， 他们开发了一种 mRNA 遗传构型 ，允许从单个开放阅读框 ( O pen reading frame, ORF) 同时表达未修饰的全长病毒 NA 和 HA 蛋白。 他们将这种方法应用到当季的甲型和乙型流感病毒， 在接种疫苗后观察到高水平的功能性抗体， 并且可以保护 雌性小鼠和雄性雪貂 免受病毒株攻击 。 这是对 mRNA 技术的又一改进使用，以天然状态高效递送多种病毒抗原，提高了季节性疫苗的功效。

应用技术 : 体外转录、 mRNA-LNP 、动态光散射 (DLS) 、酶联免疫吸附测定 (ELISA) 、血凝抑制试验 (HAI) 、酶联凝集素测定 (ELLA) 、神经氨酸酶抑制测定 (NAI) 、微量中和试验 (MN50) 、噬菌斑减少中和试验 (PRNT50) 、实时定量反转录 PCR(qRT-PCR) 等。

疫苗是对抗季节性流感病毒感染的重要手段，但由于病毒抗原的快速漂移，每年都要根据流行毒株重新制备流感疫苗，一般预防的 4 种流感病毒株为甲型流感病毒 H1N1 、 H3N2 以及乙型流感 Victoria/Yamagata 。虽然 FDA 已批准了亚单位疫苗、重组蛋白疫苗以及减毒活疫苗用于流感的预防， 但目前使用最广泛的仍为鸡胚中制备得到的灭活疫苗。由于，灭活疫苗需要 6-8 个月相对较长的生产周期，流行菌株大概率 已 发生突变。因此，季节性流感疫苗对某些 病毒 亚型 预防效果 急剧降低 ， 报道的有效性仅为 20-60% 。 mRNA 技术是新一代流感疫苗有力途径。这些疫苗由编码特定抗原的 mRNA 序列组成，包封在脂质纳米颗粒 ( L ipid nanoparticles, LNP) 中，可以诱导强大的体液免疫和细胞免疫。由于它们不会产生传染性病毒，因此这些疫苗被认为可以安全地用于免疫功能低下人群、老年人以及儿童，且易于制备。

关于相关抗原的选择， NA 和 HA 糖蛋白已成为流感疫苗的核心靶点。由于 HA 抗原可以产生中和抗体， NA 定向抗体可以提高疫苗保护的广度并限制疾病进程。 此外， NA 是一种更保守的病毒蛋白，其抗原漂移速度比 HA 慢，因此已证明广泛反应性 NA 抗体可在 NA 亚型内和跨 NA 亚型之间提供交叉反应保护。而且 疫苗设计也越来越倾向于多种病毒糖蛋白的同时递送，以实现最大程度的疫苗诱导保护。 对于递送多种抗原的 mRNA-LNP 疫苗，一般都会将病毒蛋白编码在单独的 mRNA 序列中，在接种疫苗前混合。这种方式可有效地引发部分抗体反应，但较为复杂、成本更高，而且这种糖蛋白缺乏协调的共表达。

目前，病毒 2A 位点已被广泛用于促进来自同一序列的多个单个蛋白质的表达，但该种方法会在分离蛋白质的末端残留氨基酸片段。因此，作者又参照了猪捷申病毒 2A (Porcine teschovirus 2A, PTV-2A) 以弥补上述不足。

首先，作者使用流行性 H3N2 病毒的序列 A/Tasmania/503/2020 ，通过 NA-F2A-HA 构建体编码了 NA 、 HA 糖蛋白 ( 图 1a) 。 文中使用的 HA 和 NA 序列都经过了密码子优化，以增强蛋白质表达并降低免疫原性。 序列中 poly(A) 尾 为 100 nt ， 在合成 mRNA 时 进行 了 共转录加帽，随后通过沉淀和纤维素色谱方法完成 纯化 。

在 ELISA 和显微镜中，作者发现用该质粒转染的细胞与用单独编码抗原或混合物质粒转染的细胞表达相似水平的 NA 和 HA( 图 1b-1e ) 。同样，共聚焦显微镜结果显示这些蛋白质都实现了正确的表达和运输（图 1f ）。此外，作者还发现该质粒表达的 HA 可以介导与单独表达 HA 相似的膜融合活性（图 1h ）。 上 述结果表明， NA-F2A-HA 的设计确实可以应用于疫苗设计，以从单个 ORF 表达两种功能性天然病毒蛋白。

图 1 NA 和 HA 可以从单个 DNA 构建体中正确表达

接下来，作者在小鼠身上比较了分别编码 NA 、 HA 、 NA-F2A-HA 的 mRNA-LNP 疫苗。疫苗接种后血清结果显示，单独编码 NA 或 HA 的 mRNA-LNP 疫苗引发了针对靶向 A/Tasmania/503/2020 蛋白的强烈抗体反应。 而接种 NA-F2A-HA mRNA-LNP 疫苗的小鼠对两种病毒蛋白的抗体反应相似 ( 图 2b-2e ) ，因此作者认为 HA 和 NA 都得到了适当的表达。 紧接着，作者又通过微量中和试验 (M ulticycle microneutralization, MN ₅₀ ) 和噬菌斑减少试验 (Plaque-reduction, PRNT ₅₀ ) 等手段对抗体的有效性进行了评估， 结果显示 NA-F2A-HA mRNA 构建体递送两种抗原与其他任何组别相比都具有非劣效性 (2f-2i) 。 随后，作者又用致死剂量的适应抗原相似的 H3N2 病毒（ A/Switzerland/9175293/2013 ）攻击接种疫苗的小鼠，以评估疫苗的保护性能。 结果，接种 上述 疫苗的小鼠引发了针对 两种糖蛋白 的免疫反应 ， 在感染后均存活下来且可以防止更为致命的 攻击 ，产生的免疫反应类似于接种单独、混合编码抗原的 mRNA-LNP ，其保护性能相对于当前的行业标准疫苗。

图 2 H3N2 NA-F2A-HA mRNA-LNP 对两种抗原的免疫原性

而且，作者将该疫苗的设计由起始的甲型流感 H3N2 拓展到了 H1N1 A/Victoria/2570/2019 、 IBV_V B/Washington/02/2019 和 IBV_Y B/Phuket/3073/2013 其他三种病毒株，并分别免疫小鼠 ( 图 3a) 。 疫苗接种后，根据血清分析显示，三种 NA-F2A-HA mRNA-LNP 疫苗与荧光素酶 mRNA-LNP 和灭活疫苗 Flulaval 相比，均 显著 升高了各自 NAs 和 HAs 的抗体反应 ( 图 3b-3o) 。 表明这种疫苗设计对其他流感病毒亚型也具有卓越的免疫原性。

图 3 NA-F2A-HA mRNA-LNP 对其他流感病毒亚型有卓越的免疫原性

在后续的试验中， 作者探索了编码 H1N1 、 H3N2 、 IBV-Y 或 IBV-V 毒株的 NA-F2A-HA 四价 mRNA-LNP 疫苗混合物，是否具备同时表达所有病毒类型的 NAs 和 H A s 的功效，以达到 “ 八价 ” 疫苗的效果。 作者在小鼠身上接种了等量的 NA-F2A-HA mRNA-LNP 疫苗混合物，上述四种 mRNA-LNP 的剂量是单独给药时的一半 ( 图 4a ) 。 如图 4b- 4 e 所示，我们可以看到这种疫苗混合物确实对所有四种疫苗株的 NAs 和 HAs 产生强烈的抗体反应，不劣于 Flulaval 疫苗接种后引发的抗体水平。 同时，根据 PRNT ₅₀ 测定结果，作者发现 mRNA-LNP 疫苗引起的中和病毒抗体水平明显更高，并且比接受 Flulaval 疫苗的动物反应更强 ( 图 4f- 4 i ) 。随后，文章在接受了 mRNA-LNP 疫苗混合物的小鼠身上，用致命剂量的 H1N1 、 H3N2 、 IBV_Y 三种病毒对其进行攻击 ( 图 4j-4l) 。 结果显示，所有接种了四种 mRNA-LNP 混合物或 Flulaval 的小鼠都完全免受所有病毒的致命攻击，而接种荧光素酶 mRNA-LNP 的小鼠在感染后 7-10 天内死亡 ( 图 4m- 4 o) 。 此外，在 H3N2 和 IBV_Y 病毒攻击后，相对于 Flulaval 组， 4 种 mRNA-LNP 疫苗混合物接种组的小鼠体重减轻更少。

图 4 四种 NA-F2A-HA mRNA-LNP 的混合物保护小鼠免受致命剂量病毒攻击

最后， 文章又评估了四种 mRNA-LNP 疫苗混合物在流感 典型动物 模型 — 雪貂中的保护效果。正如在小鼠中的表现一样，疫苗接种后在雪貂中引发了强烈抗体反应与中和抗体水平 ( 图 5b-5i ），且在 H1N1 、 H3N2 和 IBV_Y 病毒的抗原反应上比 Flulaval 更高。 当作者用 H1N1 毒株 A/Hawaii/66/2019 攻击雪貂时 (