细胞焦亡是一种由gasdermin (GSDM) 介导的程序性炎症细胞死亡。它通过在质膜上形成孔隙并触发促炎细胞因子的分泌来启动炎症反应，为癌症免疫治疗带来希望。已报道了许多诱导细胞焦亡的药物，包括离子、小分子治疗药物和纳米材料，突显了它们激活癌细胞焦亡的潜力。然而，这些药物中的大多数对癌细胞缺乏选择性，可能在正常组织中诱导细胞焦亡，导致全身毒性。最近，光动力疗法已成为诱导癌细胞焦亡的一种特定方法。这种光子控制的细胞焦亡有可能克服与传统细胞焦亡诱导剂相关的副作用和耐药性。尽管如此，由于光在生物组织中的穿透深度有限以及肿瘤微环境的缺氧性质，对光照射和氧气的需求限制了对深层肿瘤及其转移的疗效。迫切需要一种有效的焦亡诱导剂，它不需要光和氧气，并选择性地诱导焦亡杀死深层肿瘤和转移。
超分子相互作用参与了许多调节生命所必需的细胞功能的关键生物过。在活细胞内直接合成超分子已成为控制细胞功能和操纵细胞命运的通用策略。具体而言，合成的小分子化合物在癌细胞溶酶体内受控自组装成超分子结构已被证明可有效治疗癌。通过引起不可逆的溶酶体膜通透性 (LMP)，溶酶体内的超分子结构可诱导溶酶体功能障碍和溶酶体细胞死亡，使其能够有效克服交叉耐药性。据报道，各种能够组装成超分子结构的小分子化合物作为 LMP 诱导剂，大多由两亲性肽结构组成，其序列源自天然蛋白。由于溶酶体含有负责蛋白质降解和清除的各种蛋白酶，肽组装体易被溶酶体蛋白酶水解。这可能会降低它们在溶酶体中的稳定性并损害其治疗癌症的功效。此外，这些肽组装体主要通过凋亡相关途径诱导癌细胞死亡，而凋亡途径通常会抑制炎症，导致对“冷”肿瘤的免疫反应较弱。控制溶酶体合成具有高稳定性和效力的超分子结构，以促进选择性癌细胞焦亡，随后引发强大的抗肿瘤免疫反应，这是一个持续的挑战。
成果简介
近日，
南京大学的叶德举团队
介绍了一种新型肿瘤特异性纳米颗粒（NP-NH-D5），该颗粒能够通过破坏溶酶体来激活细胞焦亡，为癌症免疫治疗提供了新的思路。NP-NH-D5能够在肿瘤细胞溶酶体中发生负电荷到正电荷的转变，并从纳米颗粒转变为纳米纤维，这一过程通过响应细胞外基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和细胞内还原剂（如谷胱甘肽GSH）实现。形成的非肽纳米纤维能够高效破坏溶酶体，触发Gasdermin-D（GSDMD）介导的细胞焦亡，从而诱导强烈的免疫原性细胞死亡（ICD），并改善免疫抑制性肿瘤微环境。体内实验表明，NP-NH-D5能够有效抑制原位4T1乳腺肿瘤的生长，防止转移和复发，并延长生存期，且无系统性副作用。此外，它还能显著增强PD-L1抗体免疫治疗的效果，尤其在4T1晚期肺转移和侵袭性原位Pan02胰腺肿瘤模型中表现出色。
图 1 | NP-NH-D5诱导焦亡和抗肿瘤免疫反应的示意图
F-C6-NH2
的设计、合成及其自组装为纳米纤维
研究团队设计了一种非肽类小分子两亲化合物F-C6-NH2，其核心设计目标是能够在细胞内自组装成刚性纳米纤维（NFs）。
F-C6-NH2由四个关键部分组成
：
疏水的3,5-二（三氟甲基）苯基、C6烷基链、氨基氧杂荧光素（AO-Luc）荧光团和带有伯胺基团的聚乙二醇（PEG3）连接链
。其中，3,5-二（三氟甲基）苯基提供了强大的分子间疏水相互作用和氢键潜力，增强了F-C6-NH2的自组装稳定性和整体稳定性；C6烷基链对内源性还原剂（如GSH）具有抵抗力，确保了分子在生物环境中的稳定性；AO-Luc荧光团不仅通过π-π堆叠和范德华力促进自组装，还能发出绿色荧光，便于实时监测F-C6-NH2的动态变化；PEG3连接链则平衡了分子的亲水性，伯胺基团有助于氢键的形成和溶酶体内的积累。
实验中，F-C6-NH2在PBS缓冲液中表现出良好的自组装能力，其临界组装浓度约为9.3μM。通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）分析，研究团队发现F-C6-NH2能够快速形成小球形纳米颗粒和短纳米纤维，并逐渐生长为平均直径约12nm的长纳米纤维。原子力显微镜（AFM）进一步确认了纳米纤维的形成，其平均高度约为3nm，且具有较高的杨氏模量（平均值为464±75MPa），表明纳米纤维具有较高的刚性。此外，F-C6-NH2的自组装过程还通过圆二色光谱（CD）得到了验证，显示出典型的β-折叠结构特征。
图 2 | F-C6-NH2自组装成纳米纤维的表征
F-C6-NH2
自组装成纳米纤维并诱导GSDMD介导的焦亡
实验结果表明，F-C6-NH2能够进入HeLa或4T1细胞，并主要在溶酶体中积累。随着时间推移，溶酶体的荧光信号逐渐消失，
而F-C6-NH2的荧光信号保持明亮，表明溶酶体膜已被破坏
。通过生物透射电子显微镜（Bio-TEM）分析，研究团队观察到F-C6-NH2处理的HeLa细胞溶酶体中出现了密集的纳米纤维，溶酶体膜显示出明显的破裂迹象。随着时间延长，纳米纤维进入细胞质，细胞出现肿胀和严重的溶酶体损伤，最终导致细胞死亡。
此外，F-C6-NH2在HeLa和4T1细胞中表现出浓度依赖性的细胞毒性，其半数抑制浓度（IC50）分别为2.40±0.14μM和4.05±0.12μM。相比之下，其他对照化合物（如F-SS-NH2、F-C6-NHAc等）在50μM时几乎无细胞毒性。这表明F-C6-NH2的细胞毒性主要来源于其在溶酶体内的自组装过程。进一步的实验通过Western
blot分析和免疫荧光确认了成熟猫眼蛋白酶B（CatB）从溶酶体释放到细胞质中，激活了NLRP3炎症体，导致Caspase-1的剪切和GSDMD的裂解。这些结果表明，
F-C6-NH2能够通过破坏溶酶体膜，诱导GSDMD介导的细胞焦亡，并释放促炎细胞因子（如IL-1β和IL-18），从而激活免疫反应。
NP-NH-D5
的设计与制备：一种肿瘤特异性焦亡诱导剂
为了提高F-C6-NH2对肿瘤细胞的选择性，研究团队进一步设计了一种肿瘤靶向纳米颗粒NP-NH-D5。
NP-NH-D5通过共组装F-C6-NH2和F-SS-NH-GALGLP-D5制备而成，后者含有一个二硫键和一个可被MMP-2剪切的肽段。
这种设计使得NP-NH-D5能够响应细胞外的MMP-2和细胞内的还原剂（如GSH和GILT），从而实现从负电荷纳米颗粒到正电荷纳米纤维的转变。
实验中，NP-NH-D5在生理条件下表现出良好的稳定性，其粒径约为60nm，表面电位为-4.39±1.52mV。当暴露于MMP-2时，NP-NH-D5的粒径减小至约55nm，表面电位增加至+25.58±1.40mV。进一步的高分辨率质谱（HPLC）和圆二色光谱分析确认了MMP-2对F-SS-NH-GALGLP-D5的剪切作用，以及随后在GSH或GILT作用下二硫键的还原反应。最终，NP-NH-D5在细胞内成功转化为纳米纤维，诱导溶酶体膜破裂和细胞焦亡。
NP-NH-D5
选择性诱导肿瘤细胞中的GSDMD介导的焦亡
NP-NH-D5在多种肿瘤细胞（如4T1、HeLa和A549）中表现出良好的细胞摄取能力，但在MMP-2缺陷的正常细胞（如GES-1）中则无明显摄取。这表明NP-NH-D5能够通过MMP-2介导的剪切作用特异性地进入肿瘤细胞。进一步的实验通过HPLC分析确认了NP-NH-D5在肿瘤细胞内的代谢过程，检测到了F-C6-NH2和NH-GAL等代谢产物。
细胞实验结果表明，
NP-NH-D5能够显著抑制多种肿瘤细胞的生长，其IC50值在不同肿瘤细胞系中有所不同，但均低于正常细胞系。
此外，NP-NH-D5处理的肿瘤细胞表现出典型的焦亡特征，如细胞肿胀、膜泡形成和GSDMD的裂解。Western blot分析进一步确认了Caspase-1的激活和GSDMD的裂解，表明NP-NH-D5能够通过激活NLRP3炎症体和GSDMD介导的焦亡途径，诱导肿瘤细胞死亡。
图 3 | NP-NH-D5体外及细胞培养中的表征
NP-NH-D5
在体内诱导焦亡以实现抗肿瘤免疫
为了评估NP-NH-D5在体内抗肿瘤免疫治疗中的效果，研究团队在原位4T1乳腺肿瘤模型中进行了实验。实验结果表明，NP-NH-D5在肿瘤组织中具有良好的富集能力，其荧光信号在注射后8小时达到峰值，且显著高于对照组。
治疗结果显示，NP-NH-D5能够显著抑制肿瘤生长，减少肺转移，并延长小鼠的生存期
。组织学分析进一步确认了NP-NH-D5处理的肿瘤组织中存在大量纳米纤维和溶酶体损伤，表明NP-NH-D5在体内能够有效诱导细胞焦亡。
此外，NP-NH-D5处理的肿瘤组织中促炎细胞因子（如IL-1β和IL-18）的水平显著升高，这有助于激活树突状细胞（DC）的成熟和T细胞的浸润。流式细胞术分析表明，NP-NH-D5能够显著增加肿瘤组织中CD4
+
和CD8
+
T细胞的浸润，同时减少调节性T细胞（Treg）的比例。这些结果表明，
NP-NH-D5不仅能够诱导肿瘤细胞焦亡，还能通过激活免疫系统，实现对肿瘤的有效抑制。
